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O diagnóstico precoce de uma infecção riquetsial é sempre difícil e muitas vezes realizado de forma empírica, baseando-se principalmente nos sinais clínicos da doença. Exames físicos e dados referentes à prevalência endêmica e epidêmica ou enzoótica e epizoótica da doença em determinada região podem levar ao início do tratamento, mesmo antes que o diagnóstico seja confirmado laboratorialmente. Essa iniciação precoce da terapia é necessária em muitos casos, especialmente devido à demora no fornecimento dos resultados dos exames. Dessa forma, como no caso da FMB, esse início do tratamento tem como objetivo reduzir a mortalidade, uma vez que a administração precoce de antibióticos possui efeitos surpreendentes.

No entanto, o diagnóstico laboratorial é muito importante, visto que este pode prover informações importantes que podem diagnosticar a fase aguda de infecções com R. rickettsii e outros agentes de doenças riquetsiais, além de permitir o diagnóstico diferencial, já que muitas vezes os sintomas são inespecíficos, havendo necessidade de confirmação laboratorial para o estabelecimento da medicação correta. O diagnóstico diferencial das riquetsioses deve ser considerado em uma extensa lista de doenças, como erliquioses, meningococcemia, trombocitopenia, púrpura trombótica, infecção por enterovírus, febre tifóide, leptospirose, dengue, mononucleose, sepsis, etc (DANTAS-TORRES, 2007).

34 O método de Weil-Felix foi o primeiro a ser desenvolvido em 1921 e consistia na detecção de anticorpos aglutinantes no soro de pacientes, que reagem com diferentes cepas ou espécies de Proteus. Apesar de ser de fácil execução e de baixo custo, esse teste possui alta sensibilidade e baixa especificidade, sendo comum o acontecimento de reações cruzadas.

A imunofluorescência indireta (RIFI) é o teste padrão-ouro recomendado pela OMS e utilizado pelo CDC (Center for Disease Control and Prevention) e laboratórios de referência em Saúde Pública no Brasil, como Fundação Ezequiel Dias/MG, Instituto Osvaldo Cruz/RJ e Instituto Adolf Lutz/SP para o diagnóstico de riquetsioses (NASCIMENTO & SCHUMAKER, 2004). Essa técnica utiliza antígenos espécie-específicos de Rickettsia e a detecção de IgM é forte evidência de uma riquetsiose ativa (GALVÃO, 2005). A RIFI possui sensibilidade superior a 94% em amostras de soros convalescentes (MELLES et al., 1999; CHEN & SEXTON, 2008); no entanto, também ocorrem reações cruzadas entre diversas espécies de Rickettsia, não sendo possível desta forma, a distinção entre membros de riquétsias do Grupo da febre maculosa. A RIFI pode não apresentar viragem sorológica durante o início da fase aguda e por isso a terapia não deve depender da confirmação laboratorial.

O teste Elisa, com emprego de anticorpos policlonais ou monoclonais tem se mostrado tão sensível e específico quanto à RIFI no diagnóstico de RMSF, sendo inclusive mais sensível que a RIFI na detecção de baixos títulos de anticorpos, verificados após vacinação e no período tardio de convalescença (SCOLA & RAOULT, 1997). Possui como ponto negativo o longo tempo consumido para a purificação dos antígenos, além do fato de que os anticorpos espécie-específicos empregados estão disponíveis para um número limitado de espécies de riquétsias (REGNERY et al., 1991).

O Western Blotting é um método indireto que se baseia no padrão eletroforético e na identificação imunológica de epítopos específicos. Em estudos soroepidemiológicos tem demonstrado grande eficácia, tendo grande utilidade na confirmação de resultados obtidos por outros testes por possibilitar a real prevalência das riquétsias, eliminando os falsos- positivos. É um método mais sensível e específico que os demais métodos sorológicos disponíveis, sendo capaz de detectar anticorpos em fases mais recentes da doença. Como inconveniente, possui o fato de ser demorado e trabalhoso, pois exige uma purificação rigorosa da amostra sem que ocorram alterações nos epítopos específicos (SCOLA & RAOULT, 1997).

Existem ainda vários outros métodos sorológicos para o diagnóstico das riquetsioses, como aglutinação em látex, imunoensaio enzimático, hemaglutinação indireta, microaglutinação, fixação de complemento, dentre outros. Mas a RIFI é, ainda hoje, o

35 método mais usado (WALKER, 1989; JEFFREY & SILBER, 1996; KOSTMAN, 1996; CHEN & SEXTON, 2008).

Testes como Imunofluorescência Direta ou imunoperoxidase podem ser rapidamente executados através de biópsia da pele ou tecidos fixados em formaldeído, fornecendo informações úteis que podem diagnosticar estágios agudos de infecções com R. rickettsii e outros agentes de doenças riquetsiais. A sensibilidade da Imunofluorescência Direta para detectar R. rickettsii em biópsia da pele é de aproximadamente 70%, com especificidade de 100%. Entretanto, esse método não está facilmente disponível; e, muitas vezes, existe atraso na obtenção dos resultados. Além disso, pela falta de sensibilidade, um resultado negativo não pode excluir o diagnóstico de febre maculosa, enquanto um resultado positivo é evidência suficiente para paralisar a terapia de outros agentes infecciosos (DANTAS- TORRES, 2007).

Várias metodologias que visam ao isolamento do agente permitindo a sua identificação também podem ser utilizadas no diagnóstico das riquetsioses. Essas amostras incluem sangue com anticoagulante, plasma, biópsias e autópsias. O cultivo de Rickettsias iniciou-se em ovos embrionados. As células de cultura in vitro mais utilizadas em Rickettsiologia são as de embrião de galinha e células VERO (BACELLAR & SOUSA, 2004). O método “shell vial”, utilizado a partir da década de 90 para o isolamento in vitro permitiu o estabelecimento de novas culturas de estirpes de riquétsias, como R. japonica, R. honei, R. africae, R. monacensis, R. massiliae, dentre outras. Assim, o isolamento de riquétsias em cultura ainda é uma das melhores formas de se obter um diagnóstico definitivo sobre a espécie de Rickettsia, embora tenha como fator negativo o fato de que não é um método rápido (BACELLAR & SOUSA, 2004).

De acordo com nota técnica do Ministério da Saúde divulgada em agosto de 2009, considera-se como caso confirmado para FMB paciente com caso suspeito de febre maculosa com pelo menos um dos seguintes resultados laboratoriais: Isolamento em cultura do agente etiológico, Imunohistoquímica reagente para antígenos específicos de Rickettsia sp. ou RIFI quando houver soroconversão dos títulos. Esta é entendida como a primeira amostra de soro (fase aguda) não reagente e segunda amostra (14 a 21 dias após) com título igual ou superior a 128 ou aumento de no mínimo quatro vezes os títulos obtidos em duas amostras coletadas com intervalo de 14 a 21 dias.

O diagnóstico molecular através da Reação em Cadeia pela Polimerase é uma técnica que consegue amplificar pequenas quantidades de DNA microbiano em sangue e tecidos e representa um caminho adicional para a detecção rápida de uma infecção riquetsial. O uso dessa técnica para o diagnóstico de riquetsioses ainda é limitado, devido à

36 falta de sensibilidade na detecção de DNA de R. rickettsii em amostras de sangue. O número de riquétsia circulante no sangue é tipicamente baixo. Em contrapartida, essa técnica é mais apurada na detecção de R. rickettsii em amostras de tecidos de biópsias da pele ou necrópsias. Na fase aguda da doença, a confirmação laboratorial é reforçada quando a PCR está associada com técnicas imunohistoquímicas (DANTAS-TORRES, 2007). Espera-se assim que a automatização dos métodos de biologia molecular e a evolução da conservação das amostras a processar, tornem possível um diagnóstico cada vez mais rápido, sensível, específico e reprodutível em qualquer laboratório, sem a necessidade de medidas de segurança para o manipulador e para o ambiente que hoje existem (BACELLAR & SOUSA, 2004).