3. 2 Model de pneumònia experimental

As amostras beneficiadas em indústrias sob Inspeção Federal foram analisadas segundo métodos oficiais (Brasil, 1992).

As analises microbiológicas realizadas foram a contagem de Coliformes a 35 ºC e a 45º, Pesquisa de Salmonella spp, Contagem de Staphylococcus aureus e Número mais Provável (NMP) de Vibrio parahaemolyticus.

Foram empregadas técnicas oficiais, meios de cultura e reagentes recomendados para cada uma das análises (Brasil, 1992) Os resultados obtidos foram comparados com os padrões oficiais (Brasil, 2001).

4.2.1.1. Preparo das Amostras

Com auxílio de pinças, tesouras e bisturi, previamente esterelizados foi pesado assepticamente 25g da amostra colhida de vários pontos (superfície e profundidade), em sacos plásticos específicos para uso em “stomacher”.

Para as análises de Coliformes a 45ºC, Pesquisa de Salmonella spp e Contagem de Staphylococcus aureus, 25g da amostra foram adicionadas a 225ml de solução salina peptonada a 0,1%; para a análise de Número Mais Provável (NMP) de Vibrio parahaemolyticus foram pesadas 50g da amostra e adicionadas a 450ml de caldo peptonado sal a 3%. e homogeneizadas por, aproximadamente, 60 segundos em aparelho “stomacher”.

4.2.1.2 Contagem de Coliformes a 35ºC

Nesta análises a preparação inicial corresponde á diluição 10 -1 e a partir dessa diluição 10 -1 foram realizadas as demais diluições desejadas em solução salina peptonada 0,1 %.Foi inoculado 1 ml de cada diluição selecionada, em placas de Petri esterilizadas.

Para cada placa foi adicionado cerca de 15 ml de ágar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA) previamente fundido e mantido a 46°C-48ºC em banho-maria. Em seguida homogeneizado em superfície plana e ficando em repouso até total solidificação do meio.Foi adicionado sobre cada placa, cerca de 10ml de VRBA formando uma segunda camada de meio até a completa solidificação deste e em seguida encubadas em posição invertida a temperatura de 36 ± 1°C por 18 a 24 horas. Foram selecionadas as placas que continham entre 15 e 150 colônias, onde três a cinco colônias e estas submetidas às provas confirmativas, inoculando cada uma das colônias típicas e atípicas selecionadas em tubos contendo caldo verde brilhante bile 2% lactose. Os tubos foram encubados a 36 ± 1°C por 24 a 48 horas.

A leitura fora realizada levando em consideração a presença de coliformes totais é confirmada pela formação de gás no interior do tubo de Durhan.

4.2.1.3 Contagem de Coliformes a 45ºC

As colônias suspeitas para coliformes a 35ºC foram inoculadas em tubos contendo caldo Escherichia coli (caldo EC) e incubadas em tubos a 45 ± 0,2°C, por 24 a 48 horas em banho-maria com agitação. A leitura, foi realizada considerando a presença de coliformes a 45ºC é confirmada pela formação de gás no tubo de Durhan.

4.2.1.4.Contagem de Staphylococcus aureus

Foram usadas duas diluições decimais ou duplicatas da mesma diluição, semeando cada inoculo, pela técnica “Spread Plate”, com um ml de cada diluição em três placas de Petri contendo Ágar Baird-Parker, previamente secas, e distribuindo 0,4 ml, 0,3 ml e 0,3ml por placa.

Após o inoculo ser absorvido pelo ágar (cerca de 10 minutos) as placas foram encubadas invertidas a 36 ± 1ºC por 30 a 48 horas. As contagens de colônias típicas e atípica foram registradas separadamente. Em seguida foram selecionadas três a cinco colônias de cada tipo típicas (T) e atípicas (A), e semeadas em tubos contendo Caldo cérebro-coração (BHI), para confirmação, e incubadas a 36 ± 1ºC, por 24 horas. A partir da cultura pura em BHI foram realizadas as seguintes provas complementares e confirmativas :

Prova da Coagulase

Foi transferido 0,3 ml de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estéreis contendo 0,3 ml de plasma de coelho e incubados a 36 ± 1ºC por 6 horas, onde foi observado a presença ou não de coágulos.

Coloração de Gram

Foram preparados os esfregaços das colônias e em seguida corado pelo método de Gram. A ausência de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. A presença de cocos Gram positivos indica a necessidade da realização de testes complementares.

Pesquisa de termonuclease

Foram feitos orifícios eqüidistantes com 2 mm de diâmetro no ágar para ensaio de termonuclease ou no ágar azul de toluidina - DNA, em placas previamente preparadas. Os tubos das culturas foram mantidos em caldo BHI, em banho-maria por 15 minutos. Após esfriar e preencheu – se completamente, um orifício para cada cultivo analisado e em seguida incubados a 36 ± 1ºC por 4 horas ou a 50 ± 2ºC por 2 horas.

Prova da Catalase

Com auxílio de alça de platina, bastão de vidro, palito de madeira ou pipeta de Pasteur, estéreis, foi retirado uma alíquota do cultivo em ágar estoque e transferido para uma lâmina ou placa de vidro contendo uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%,misturando o inoculo ao peróxido. A não formação de borbulhas indica prova negativa para catalase. O Staphylococcus aureus é catalase positiva.

4.2.1.5. Número mais Provável (NMP) de Vibrio parahaemolyticus.

Após pesar 50g da amostra foi adicionada a 450 ml de Caldo peptonado sal 3%, homogeneizou – se por, aproximadamente, 60 segundos em “stomacher”. Inoculado em caldo de enriquecimento seletivo a partir da diluição inicial (10 -1), realizou as demais diluições desejadas em Caldo peptonado sal 3% . Volumes de 1 ml de cada uma das diluições foram inoculadas em três séries de três tubos contendo caldo glicose sal teepol (GSTB) ou caldo Horie Arabinose Violeta de Etila (HAEB) e incubado em tubos a 36 ± 1°C por 18 horas a 24 horas.Realizou a leitura; a presença de turvação do meio indica suspeita da presença de Vibrio parahaemolyticus.

Em seguida foi realizado o isolamento em ágar tiosulfato citrato sais biliares (TCBS). a partir tubo de GSTB ou HAEB que apresentaram turvação, sem agitá-lo e com auxílio de uma alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, retirou-se uma alçada do crescimento na superfície e estriou sobre a superfície seca TCBS e incubou em placas em posição invertida a 36 ± 1ºC por 24horas. O aparecimento de colônias arredondadas, opacas, de cor azul esverdeada, com 2 a 3 mm de diâmetro é indicativo de isolamento de V. parahaemolyticus.

4.2.1.6 Pesquisa de Salmonella spp

Foi adicionado 225 ml de solução salina peptonada 1% tamponada à alíquota de 25 g da amostra previamente pesada e em seguida homogeneizado por aproximadamente 60 segundos no “stomacher Permanecendo uma hora em temperatura ambiente; após este período foram realizadas as seguintes etapas.

Pré-enriquecimento: foi realizado por incubação a 36 ± 1ºC das alíquotas das amostras, durante um mínimo de 16 horas e não mais que 20 horas.

Enriquecimento seletivo: a partir do pré-enriquecimento a inoculação foram realizadas simultaneamente, nos meios líquidos seletivos:

a) Caldo Rappaport Vassiliadis: Pipetou – se alíquotas de 0,1 ml das amostras pré- enriquecidas para tubos contendo 10 ml de caldo Rappaport Vassiliadis e os tubos foram incubados a 41 ± 0,5ºC, em banho-maria, com agitação ou circulação contínua de água, por 24 a 30 horas.

b) Caldo selenito cistina: Com o auxílio da pipeta foi retirado 1 ml das amostras pré- enriquecidas,e transferindo para tubos contendo 10 ml de caldo selenito cistina. Os tubos

foram incubados a 41 ± 0,5ºC em banho-maria, com agitação ou circulação contínua de água, por 24 a 30 horas.

c) Caldo tetrationato: Foi retirado alíquotas de 1 ml das amostras pré-enriquecidas e transferindo para tubos contendo 10 ml de caldo tetrationato.e incubado em tubos a 41 ± 0,5ºC em banho-maria, com agitação ou circulação contínua de água, por 24 a 30 horas.

d) Isolamento em meio sólido: a partir de enriquecimento em caldos seletivos, repicou sobre a superfície previamente seca de placas com cada meio sólido seletivo, estriando de forma a se obter colônias isoladas.

Dessa forma foram obtidas 2 placas de BPLS, uma originária do caldo Rappaport Vassiliadis e outra originária do caldo selenito cistina. Todas as placas foram incubadas , invertidas, a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas e após este período foi selecionado de 3 a 10 colônias suspeitas por amostra.

Provas Bioquímicas Produção de uréase

Semeou-se maciçamente em caldo ou ágar uréia. Incubou-se a 36 ± 1ºC por 24 a 30 horas observando a coloração do meio. A manutenção da cor inicial do meio indica que não ocorreu hidrólise da uréia. A alteração para rosa intenso é indicativo de alcalinização do meio devido à ação da urease sobre a uréia. A Salmonella não produz urease.

Reações em ágar três açúcares ferro (TSI) ou ágar Kligler (KIA)

O ágar foi inoculado através de picada profunda e estriamento na superfície inclinada do bisel e incubado a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.A maioria das salmonelas apresenta no TSI e no KIA as seguintes reações.Ácido na base, com ou sem produção de gás; alcalino ou inalterado no bisel com produção de H2S.

Descarboxilação da lisina

Utilizou o ágar lisina ferro (LIA), e posteriormente adicionando selo estéril (váspar, vaselina, parafina). Inoculou – se através de picada profunda, estriando também na superfície inclinada do bisel. Incubou a 36 ± 1ºC por 24a30 horas, observando se ocorreu descarboxilação da lisina pela alcalinização do meio, o que é demonstrado pela não alteração de cor do indicador presente,com viragem do indicador púrpura de bromocresol, de violeta para amarelo.

A descarboxilação da lisina, que ocorreu posteriormente, resulta na produção de uma diamina (cadaverina) e CO2, que conferem ao meio características de alcalinidade e nova

viragem da cor do indicador, que passa de amarelo para violeta. A maioria das salmonelas é capaz de produzir lisina descarboxilase.

Motilidade no Meio SIM

Inoculou com picada no meio de cultura e incubou a 36 ± 1ºC por 24 a 30 horas. A motilidade é caracterizada pela difusão do crescimento por todo o meio. Se for restrito à linha de semeadura, indica que o microrganismo é imóvel. A maioria das salmonelas apresenta motilidade positiva.

Após a leitura da motilidade e da produção de H2S, adicionou algumas gotas de

reativo de Kovac´s aos tubos para verificar se houve produção de indol. A adição do reativo de Kovac´s resulta na formação de um anel vermelho, resultante da reação entre o indol e o dimetilaminobenzaldeído contido nesse reativo. Quase a totalidade das salmonelas não produz indol

Prova da Oxidase

Foram usados palitos de madeira, de plástico descartáveis ou pipetas Pasteur, estéreis, ou alça de platina; realizou a prova de oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase, ou sobre tiras de papel para teste de Oxidase. A leitura foi realizada em 10 a 20 segundos. O aparecimento de cor azul ou vermelho intenso é indicativo de reação positiva. Todas as salmonelas apresentam reação de oxidase negativa.