3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. miRNAs pro-adipogénicos del TAB
A administração de 40pM de ET-1 no córtex sensóriomotor primário de ratos Wistar adultos machos foi visualizada em secções coronais de 30µm de espessura, evidenciada pela coloração com violeta de cresila nos grupos experimentais com tempos de sobrevida 1 e 7dias. A área de lesão foi caracterizada pelo palor tecidual, morte celular no centro de lesão e penumbra isquêmica, além da presença de infiltrado inflamatório (Figura 11).
Foi evidenciada uma maior área de lesão nos animais do grupo controle tratados com água destilada (Figura 11A e 11C) em comparação aos animais submetidos ao tratamento com 3mg/kg de Edaravona (Figura 11E e 11H). A média das áreas de lesão dos animais do grupo controle nos tempos de sobrevida 1 e 7 dias foram 264,5mm² e 230,3mm² respectivamente. Animais tratados com edaravona nos tempos de sobrevida 1 e 7 dias obtiveram uma redução na área de lesão para os valores 136,2mm² e 78,6mm² respectivamente, isso representou uma redução na área de infarto de 49% em 24h e de 66% sete dias após a lesão, quando comparados aos seus respectivos controles (Figura 12).
43 Figura 11: Animais submetidos à isquemia focal e tratados apenas com água destilada, após 24h já apresentam lesão tecidual característica com área de lesão de ±264,5 mm²(A) além de sofrer vigorosa infiltração de células com características morfológicas de neutrófilos (B). Os animais do grupo controle de 7dias de sobrevida apresentaram uma área de lesão com ± 230 mm² (C) acompanhada de um infiltração massiva de células com morfologia de macrófagos mononucleares (D). Animais tratados com edaravona, já em 24 horas tiveram diminuição na área de infarto para ± 136,2mm² (E) e redução na infiltração de células com morfologia de neutrófilos (F). Os animais tratados com tempo de sobrevida de 7dias apresentam considerável neuroproteção, apresentando uma área de lesão de ± 78,6mm² (G) além de ter uma redução na presença de células com morfologia de macrófagos mononucleares (H). *: Centro de lesão. ►: Neutrófilos. A,C,E e G escala de 150 µm. B,D,F e H: escala de 50µm.
44 Figura 12: O tratamento com Edaravona reduz a área de lesão de animais submetidos à isquemia focal experimental no córtex sensóriomotor primário tanto 24h quanto sete dias pós- lesão. (*p<0,05; **p<0,01 – ANOVA - Tukey).
3.2 INFILTRAÇÃO DE NEUTRÓFILOS
Verificou-se a maciça presença de neutrófilos no córtex sensóriomotor primário já em 24h após o início da lesão isquêmica em animais do grupo controle (Figura 13A e 13B), já em animais em animais do grupo tratamento para o mesmo tempo de sobrevida (Figura 13E e 13F), houve uma redução significativa na presença de neutrófilos infiltrantes. A média de células MBS-1+ em animais do grupo controle em 24h foi ± 68,60 células/campo, já a média do grupo tratamento para o mesmo tempo de sobrevida foi ± 30 células/campo (Figura 14). Os animais com tempo de sobrevida de sete dias apresentaram poucos neutrófilos, seja no grupo controle (Figura 13C e 13D) com média de ± 9,26 células/campo (Figura 14) quanto no grupo tratamento Figura (13G e 13H) cuja média foi ± 9,78 células/campo (Figura 14).
0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0 300,0
Grupo Controle 1D Grupo Tratamento 1D Grupo Controle 7D Grupo Tratamento 7D
Á rea de Lesão ( m m ²)
**
**
**
*
45 Figura 13: Animais do grupo controle submetidos à isquemia focal apresentam vigorosa infiltração de neutrófilos 24h após o início da lesão isquêmica (A e B). Após 7 dias, os animais do grupo controle apresentam uma menor quantidade de neutrófilos (C e D). O tratamento agudo com edaravona reduziu a presença das células MBS-1+ em 24h (E e F). Os animais tratados durante seis dias consecutivos também apresentaram redução na presença dessas células.
46 Figura 14: O tratamento com edaravona foi eficaz em reduzir a presença de neutrófilos 24h após o início da lesão isquêmica nos animais do grupo tratamento, entretanto, foi ineficaz em reduzir a infiltração dessas células nos animais do grupo tratamento sete dias após o início da lesão.
3.3 ATIVAÇÃO MICROGLIAL
A avaliação da célula microglial na fisiopatologia isquêmica foi realizada com o uso do marcador denominado ED1, o qual reconhece um epítopo específico na membrana do lisossomo de macrófagos/micróglia ativados. Os animais do grupo controle tiveram uma maior presença de macrófagos/micróglia ativados no sítio de lesão (Figura 15A, 15B, 15C e 15D) em comparação aos animais do grupo tratamento (Figura 15E, 15F, 15G e 15H). A média das contagens do grupo controle para os tempos de sobrevida 1e 7 dias foram ± 12,69 células/campo e ± 46,19 células/campo respectivamente (Figura 16). Os animais do grupo tratamento obtiveram médias de ± 8,22 células/campo e ± 26,86 células/campo para os tempos de sobrevida 1e 7 dias respectivamente (Figura 16).
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0
Grupo Controle 1D Grupo Tratamento 1D Grupo Controle 7D Grupo Tratamento 7D
N º Cé lu las MBS -1 +/campo
**
**
47 Figura 15: A edaravona diminui a presença de células ED1+ em animais submetidos à isquemia focal no córtex sensóriomotor primário. Animais do grupo controle 24h após o início da isquemia já apresentam células microgliais ativadas (A e B). Animais do grupo controle sete dias após o início da lesão apresentam uma quantidade ainda maior células ED1+ (C e D).
Animais tratados com edaravona têm uma redução na presença dessas células ativas no sítio de lesão, tanto em 24h (E e F) como em 7dias (G e H) após o início da lesão. ►: Micróglia ativada. A,C,E e G escala de 150 µm. B,D,F e H: escala de 50µm.
48 Figura 16: O tratamento com edaravona foi eficaz em reduzir a quantidade de células ED1+ no córtex sensório motor primário no grupo tratamento 7 dias após o início da lesão. (**p<0,01 – ANOVA - Tukey). 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0
Grupo Controle 1D Grupo Tratamento 1D Grupo Controle 7D Grupo Tratamento 7D
N º Cé lu las E D1 +/ ca m p o
**
**
49
4. DISCUSSÃO
4.1 CONSIDERÇÕES TÉCNICAS
No presente estudo induzimos isquemia no córtex sensóriomotor primário com microinjeções de ET-1. O presente modelo utilizou 1µL de ET-1 a 40pM, sendo eficaz em induzir uma lesão caracterizada por inflamação aguda, perda de pericários neuronais e morte celular. Estes achados estão de acordo com estudos previamente publicados (DOS SANTOS et al., 2007; HUGHES et al., 2003). Os estudos utilizando ET-1 no SNC foram pioneiramente descritos por Fuxe e colaboradores (FUXE et al., 1989), onde foi evidenciado produção de lesão bem como os sítios de ligação da ET-1 no parênquima neural. A administração central desse peptídeo vasoconstritor reduz o fluxo sanguíneo local em torno de 60% (HUGHES et al., 2003).
O modelo experimental utilizando uma micropipeta de vidro foi descrito com sucesso por Hughes e colaboradores (HUGHES et al., 2003) e reproduzido em trabalhos do nosso grupo (DOS SANTOS et al., 2007; SOUZA- RODRIGUES et al., 2008).
4.2 O TRATAMENTO COM EDARAVONA PROMOVE NEUROPROTEÇÃO DO CÓRTEX SENSÓRIOMOTOR PRIMÁRIO
O presente estudo avaliou o possível efeito neuroprotetor da edaravona em modelo experimental de isquemia focal. Os resultados sugerem que a edaravona apresenta um efeito neuroprotetor do córtex sensóriomotor a partir de 24h, estendendo-se até sete dias após o início do processo isquêmico pelo modelo proposto. Os resultados apresentados estão de acordo com trabalhos previamente publicados, onde se demonstrou que o tratamento agudo com 3mg/kg de edaravona confere conspícua neuroproteção (AMEMIYA et al., 2005; KAWAI et al., 1997; XIAO et al., 2007; ZHANG, P. et al., 2012), entretanto, poucos trabalhos investigaram a capacidade neuroprotetora do fármaco em um tratamento subagudo (YAMAMOTO, Y. et al., 2009).
Na presente investigação, os resultados sugerem que o tratamento sistemático durante seis dias consecutivos com edaravona, confere uma maior proteção tecidual em relação ao esquema de tratamento frequentemente
50 empregado, onde se utiliza apenas duas administrações do fármaco (AMEMIYA et al., 2005; NOOR et al., 2005).
4.3 A EDARAVONA REDUZ A INFILTRAÇÃO DE NEUTRÓFILOS NA ÁREA DE LESÃO
De acordo com o presente paradigma experimental, foi evidenciada a presença vigorosa de neutrófilos na área de lesão nos animais de experimentação do grupo controle 24horas após o início da lesão. Os animais submetidos ao tratamento com 3mg/kg de edaravona, tiveram uma menor presença desses neutrófilos auxiliando na redução da área de lesão. Estes achados histopatológicos estão de acordo com trabalhos prévios que fizeram o relato da infiltração dessas células no parênquima isquêmico na mesma janela temporal (DEL ZOPPO et al., 1991; GARCIA et al., 1994; HALLENBECK et al., 1986). Sabe-se ainda que o processo isquêmico modula o microambiente acometido, favorecendo a expressão de moléculas de adesão em vasos endoteliais no encéfalo (HESS et al., 1994), onde estas células acumulam-se na luz do endotélio, dificultando a reperfusão local e contribuindo com a exacerbação da isquemia (MORI et al., 1992), propondo uma importante participação das células endoteliais na infiltração de neutrófilos no parênquima lesionado. Somando-se a essas evidências, foi observado que inibição da aderência de neutrófilos no endotélio do vaso sanguíneo bem como a depleção experimental de neutrófilos apresenta um papel neuroprotetor em animais submetidos à MCAO (MATSUO, 1994; MORI et al., 1992).
Wen e colaboradores demonstraram experimentalmente que a edaravona está envolvida na infraregulação da via envolvida no processo inflamatório JNK-c-Jun (WEN et al., 2006). Os resultados sugerem que a edaravona possa estar atuando na regulação de vias de vias sinalização envolvidas no processo inflamatório culminando com a redução na infiltração de neutrófilos.
51 4.4 A ATIVAÇÃO MICROGLIAL É REDUZIDA COM O TRATAMENTO COM EDARAVONA
O tratamento consecutivo por seis dias com 3mg/kg de edaravona propiciou conspícua neuroproteção acompanhado de redução na ativação de células microgliais no sítio de lesão.
Nesse contexto, há de se considerar a chamada Face de Janus microglial, onde esta célula glial apresenta um comportamento fisiopatológico aparentemente dual. Nesse sentido, importantes estudos apontam a importância da célula microglial na exacerbação do processo isquêmico (YRJANHEIKKI et al., 1998; YRJANHEIKKI et al., 1999), entretanto, outros estudos apresentam resultados diametralmente opostos, sugerindo para um papel benéfico da micróglia (LALANCETTE-HEBERT et al., 2007; NEUMANN, J. et al., 2006; NEUMANN, J. et al., 2008).
Recentemente, um número crescente de evidências experimentais leva a ser considerada a coexistência de subpopulações microgliais do tipo M1 e M2 em nichos anatômicos discretos, onde essas subpopulações responderiam de maneira diferenciada aos fatores liberados nesses nichos anatômicos (GOMES-LEAL, 2012). Estudos experimentais sugerem que essas diferentes subpopulações são ativadas em diferentes momentos no progresso da fisiopatologia do processo isquêmico, onde a micróglia atingiria um platô máximo de ativação em torno de sete dias, sendo o fenótipo M2 primeiramente ativado, exibindo um perfil antiinflamatório, e posteriormente, em um tempo mais tardio o fenótipo M1 com um perfil próinflamatório também seria ativado (GIRARD et al., 2013; HU et al., 2012).
De acordo com nossos resultados, é possível sugerir que a edaravona poderia estar modulando de forma diferenciada a ativação dos fenótipos M1 e M2 das células microgliais nas diferentes janelas temporais.
52
5. CONCLUSÃO
A Endotelina-1 na concentração de 40pM é capaz de promover isquemia focal do córtex sensóriomotor primário em ratos adultos.
A infiltração de neutrófilos na área de lesão e ativação microglial exacerbam o processo isquêmico.
O tratamento com 3mg/kg de edaravona durante seis dias consecutivos foi eficaz produzir neuroproteção.
São necessários mais estudos para elucidar de que maneira a edaravona age na diminuição da infiltração de neutrófilos e redução da ativação microglial.
O esquema de tratamento proposto na presente investigação configura-se como uma alternativa terapêutica promissora para o futuro uso clínico.
53
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