miRNAs que promueven la marronización o desarrollo del TAM

Os leucócitos peritoneais de animais com sepse tratados com sepse produziram altos níveis de ERO mesmo sem a estimulação com tBHP comparado aos animais Sham. Todos os tratamentos (A. brasiliensis, I. paraguariensis ou Ceftriaxona) foram capazes de manter a produção de ERO similar aos animais Sham como mostrado na figura 38-A. Quando as células foram estimuladas com o agente oxidante tBHP, os leucócitos de animais com sepse tratados com salina produziram altos níveis de ERO similar ao grupo sham, e todos os tratamentos, e

principalmente o A. brasiliensis e I. paraguariensis, inibiram a produção de ERO induzida pelo tBHP (Figura 38-B). 0.0 200000.0 400000.0 600000.0 800000.0 1000000.0

Sham Sal Cef Ab Ilex

CLP (Sepse) *# * * A) Sem estímulo # *# IN T E N S ID A D E D E F L U O R E S C E N C IA ( U A ) 0.0 2000000.0 4000000.0 6000000.0 8000000.0 * *# *# B) Com estímulo - tBHP (40M)

Sham Sal Cef Ab Ilex

CLP (Sepse) *# IN T E N S ID A D E D E F L U O R E S C E N C IA ( U A )

Figura 38: Liberação de ERO dos leucócitos peritoneais dos animais com sepse. Leucócitos provenientes dos animais Sham, e dos animais com sepse pré-tratados com Ceftriaxona (20 mg/kg), com extrato aquoso de A. brasiliensis (135 mg/Kg) e com extrato aquoso de I. paraguariensis (22,2 mg/Kg) foram removidos após 24 horas da CLP e incubados ou não com tBHP e produção de ERO foi avaliada por fluorescencia.*p<0,05 comparado ao controle Sham, #p<0,05 comparado ao grupo CLP+salina.

6 DISCUSSÃO

Um estudo publicado pelo Instituto Latino Americano de Sepse (ILAS) em 2014, 59,5% dos pacientes internados (que constam no banco de dados Nacional- cerca de 112 hospitais públicos e privados) apresentam sepse grave, no período de 2005 a 2014, com a taxa de mortalidade de 31,6% (ILAS, 2014). Evidenciando a importância da busca de novos fármacos a partir de produtos naturais, como plantas e cogumelos medicinais, que visem a reverter essa situação que a cada ano agrava.

Em nosso trabalho o método de extração foi a infusão, a qual é amplamente utilizada, além de ser a forma na qual se mais consome mundialmente os produtos naturais (BRAIBANTE et al. 2014). Foi avaliada a atividade antimicrobiana, antioxidante e imunomoduladora do cogumelo A. brasiliensis, popularmente conhecido como cogumelo do sol, e do extrato de I.

parguariensis conhecido como erva-mate.

No presente estudo, o cogumelo A. brasiliensis in vitro não apresentou atividade antimicrobiana e nem efeito citotóxico, reduziu a capacidade fagocítica dos macrófagos peritoneais, reduziu a produção de NO e mostrou ser antiproliferativo, além disso, teve uma excelente atividade antioxidante. In vivo, o cogumelo foi capaz de aumentar a sobrevida dos animais sépticos, diminuiu o influxo de leucócitos para o sitio inflamatório, foi capaz de reverter as alterações hematológicas, apresentou atividade antimicrobiana, reduziu os níveis de NO, MDA, além de aumentar a capacidade antioxidantes nestes animais e reduzir a produção de ERO.

O I. paraguariensis in vitro apresentou atividade antimicrobiana frente à gram-negativa e gram-positiva e frente à leucócitos peritoneais teve efeito citotóxico, também aumentou a capacidade fagocítica dos macrófagos peritoneais, aumentou os níveis de NO e reduziu na presença de LPS, teve efeito proliferativo em esplenócitos, e atividade antioxidante. In vivo, o extrato aumentou a sobrevida dos animais sépticos, aumentou o influxo de mononucleares, potencializou as alterações hematológicas dos animais, reduziu a carga bacteriana, diminuiu a produção de NO e MDA, aumentou a capacidade antioxidante e reduziu a produção de ERO.

Segundo a literatura o A. brasiliensis é rico em proteínas, carboidratos e minerais além de polissacarídeo que possuem diversas propriedades medicinas como imunomoduladora (NAVEGANTES et al. 2013) especialmente em β-glucana (HARDY, 2008). Este polímero, mostrou ser capaz de ativar os leucócitos e outras células do sistema imunológico, além de induzir a produção de mediadores pró-inflamatórios (CHANPUT et al. 2012), capacidade antitumoral (REN, PERERA e HEMAR, 2012), antioxidante (TOKLU et al. 2006; MOURÃO

et al. 2011), anti-inflamatória (DORE et al. 2007). Estudos mostram que cogumelos como

Agaricus biosporus, Lactarius rufus (RUTHES et al. 2012) e o Agaricus blazei Murril

(BERNARDSHAW, 2006) elevaram a sobrevida de animais sépticos.

Autores relatam que o I. paraguariensis tem em sua composição polifenóis, xantinas e derivados do cafeoil, além de vitaminas (KASPARY e VALDUGA, 2008; BOJIC et al. 2013). Apresenta propriedades antioxidantes, vasodilatadora, efeitos antimutagênicos (BRACESCO et al. 2011), anti-inflamatória (SCHUBERT et al. 2007). Com isso, assim como os cogumelos, também existem estudos na literatura comprovando o efeito de outras plantas medicinais no tratamento da sepse, tais como Camelia sinensis (SCOPARO et al. 2012), Eugenia uniflora (RATTMANN et al. 2012) e Corudalis bugeana Turcz (HE et al. 2014).

Inicialmente, avaliou-se a atividade antimicrobiana in vitro dos extratos aquosos de A.

brasiliensis e de I. paraguariensis frente às bactérias S.aureus e E.coli, que são importantes

agentes etiológicos causadores de infecções de tecido profundo, bacteremias e sepse, que apresentam elevada resistência aos antimicrobianos disponíveis (POWERS e WARDENBURG, 2014). Os dados mostraram que o extrato aquoso de A. brasiliensis apresentou fraca atividade antimicrobiana in vitro frente às bactérias testadas, sendo que as concentrações capazes de inibir 50% (IC50) das cargas bacterianas foram de 32,20mg/mL para

S.aureus e 121,85mg/mL para E.coli. Nesse sentido, LUND et al. (2009) também avaliaram a

atividade antimicrobiana de diferentes extratos etanólicos de A. brasiliensis (100% de EtOH, EtOH a 75%, e 50% de EtOH, v / v) frente à Streptococcus mutans e Streptococcus sobrinus. Neste estudo o extrato etanólico 100% apresentou inibição do crescimento bacteriano, com CIM e CBM entre 87,4 e 444,5mg/mL.

Stojkovic et al. (2014) avaliou a atividade antimicrobiana in vitro dos extratos etanólico e metanólico de A. brasiliensis frente à S.aureus, Bacillus cereus, Micrococcus flavus, Listeria

monocytogenes, Pseudomonas aeroginosa, Salmonella typhimurium, E.coli e Enterobacter

cloacae. Todos os extratos apresentaram baixa atividade antimicrobiana, sendo que o extrato

etanólico mostrou ser mais eficaz do que o metanólico. Essa diferença de atividade é explicada por Mazzutti et al. (2012), em que diferentes técnicas de extração e solventes aplicados à A.

brasiliensis leva à diferentes atividades frentes à diversos tipos de bactérias.

Em relação ao extrato aquoso de I. paraguariensis, nossos dados mostraram que esta planta possui propriedades antimicrobianas frente às bactérias gram-positiva (S. aureus) e gram-negativa (E. coli), com valores de CIM de 1,85 e 3,70 mg/mL, respectivamente. Além disso, este extrato apresentou ação bactericida, visto que a razão entre o CIM e CBM foi inferior

à quatro para ambas as bactérias, seguindo os critérios de Tetz e Tetz (2015). Estes dados já vêm sendo mostrado nos últimos anos, em que diversos estudos relataram o potencial antimicrobiano do extrato de Ilex paraguariensis frente às bactérias gram-positivas, negativas e a fungos (BIASI et al. 2009). Nesse sentido, Martin et al. (2013) mostraram que tanto o extrato metanólico como o etanólico de erva-mate apresentou atividade antimicrobiana frente à S.

aureus, L. monocytogenes, S. enteritidis e à E. coli, em diferentes concentrações de 0,78 a

25mg/mL. Outro estudo realizado por BIAISI et al. (2009), em que foi testado o extrato de folhas e ramos de I. paraguariensis nas concentrações de 50 e 100mg/mL frente à diferentes bactérias (E.coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, S.aureus, Staphylococcus

epidermidis). Os dados mostraram que o extrato apresentou atividade antimicrobiana na menor

concentração, principalmente contra P.mirabilis, S. aureus, S.epidermidis e C. albicans. Diferentemente de Burris et al. (2011), em que o extrato aquoso de erva-mate, obtido de diversos lugares, teve atividade antimicrobiana frente à E.coli e S.aureus.

A atividade antimicrobiana de I. paraguariensis tem sido atribuída à diversos fatores. Kubo et al. (1993) mostraram que extratos de erva-mate apresentaram efeito antimicrobiano frente à Streptococcus mutans e dez compostos foram identificados com potencial antimicrobiano: linalol, alfa-ionona, beta-ionona, alfa-terpineol, ácido octanoico, geraniol, 1- octanol, nerolidol, geranilactenona e eugenol. Além disso, estes extratos mostraram ser rico em compostos fenólicos, que são os principais responsáveis pela atividade antimicrobiana (MARTIN et al. 2013). Um estudo realizado por Martin (2013), mostrou a relação do pH com a atividade antimicrobiana, no qual o extrato inibiu o crescimento de S. aureus no pH 7 e 8, no entanto no pH 6 não foi mais capaz de inibir o crescimento bacteriano, o mesmo aconteceu quando foi testado frente à L.monocytogenes e S.Enteritidis. Fonseca et al. (2000) também mostraram que o extrato de I. paraguariensis possui efeito genotóxico e mutagênico, com indução lisogênica em bactérias com pontos de mutação, o que levaria à morte bacteriana.

Posteriormente, avaliou-se o efeito das diferentes concentrações dos extratos aquosos de A. brasiliensis e I. paraguariensis em macrófagos peritoneais murinos. Na citotoxicidade, o extrato de A. brasiliensis manteve as células viáveis em todas as concentrações testadas, com uma concentração citotóxica 50% de 581,12 mg/mL. Estes dados foram semelhantes ao estudo de De Kuo et al. (2002), que mostraram que células polimorfonucleares do sangue periférico humano incubadas com frações de A. brasiliensis em diferentes concentrações por quatro dias, manteve as células viáveis.

Outros estudos avaliaram a toxicidade deste cogumelo, Chang et al. (2012), administrou doses de 0,1 e 10,5 mg/rato diariamente por 28 dias, e observaram que não houve alteração

histológica e macroscópica significativa nos órgãos avaliados. Frente às células tumorais mesmo em baixas concentrações, como a 0,33mg/mL apresentando atividade citotóxica (ORSINE et al. 2013). Esta atividade foi atribuída ao polissacarídeo β-glucana, presente em grande quantidade em A. brasiliensis. (PARK et al. 2003). Além disso, Kobayashi et al. (2005) mostraram que a β-glucana induz a fosforilação de p38MAPK em células de câncer ovariano, e administração de um inibidor da p38MAPK antes do tratamento com o polissacarídeo inibiu este efeito citotóxico. Com isso, estes autores sugeriram que A. brasiliensis pode interagir com o p38 MAPK e p53, levando à parada do ciclo G2/M, consequentemente a morte celular. Outro mecanismo proposto, para a apoptose induzida pelo extrato, é a de que o A. brasiliensis pode atuar por um mecanismo mitocondrial, mediado por ERO, aumentando a atividade de caspases (KIM et al. 2011).

Quando testado a viabilidade celular da I. paraguariensis, as concentrações maiores de 7,41 e 14,83mg/mL reduziram significativamente a viabilidade celular, semelhante a literatura. Wnuk et al. (2009) testaram a infusão de mate em cultura de linfócitos, e observou que em altas concentrações levou a apoptose e ao aparecimento de micronúcleos, confirmando a citotoxidade e a genotoxidade do extrato. Além disso, os autores sugeriram que tal efeito pode ser devido a presença da cafeína e xantina, porém os efeitos foram dependentes do tipo celular e da concentração do extrato, assim como a cafeína em concentrações de 10mM pode induzir apoptose e a parada do ciclo celular (JANG et al. 2002; GABRIELLI et al. 2007).

Goldenberg (2002), afirma que o uso constante de chá mate foi considerado um fator de risco para o câncer de orofaringe e oral, assim como diversos estudos epidemiológicos demonstram a relação entre a bebida mate com o risco de câncer (WNUK et al. 2009). Além disso, Leitão e Braga (1994) e Fonseca et al. (2000) relataram que o extrato de I. paraguariensis aumentou a frequência de aberrações cromossômicas em células periféricas humanas.

A partir dos valores encontrados de CC50 e IC50 foi possível calcular o índice de

seletividade (IS), sendo considerado significativo um valor IS maior ou igual a 10 (GALLÉ et al. 2013). Este índice possibilita inferir se um extrato é mais seletivo para as células eucarióticas ou para os micro-organismos testados. No presente estudo, o extrato aquoso de A. brasiliensis apresentou maior seletividade para S.aureus (18,04), e menor para E.coli (4,77), por outro lado o I. paraguariensis foi menos seletivo tanto para S.aureus (4,57) quanto para E.coli (2,11).

Dessa forma, um extrato deve ser mais seletivo para o agente patogênico haja vista que os PMNs e macrófagos tem um papel importante na destruição de patógenos. Tais células migram para o sítio inflamatório para reconhecer, ingerir e degradar estes micro-organismos, processo chamado de fagocitose (FREEMAN e GRINSTEIN, 2014). Além disso, estas células

podem fagocitar partículas, células mortas e detritos ambientais, e também são responsáveis pela apresentação de antígenos às células T, com produção de citocinas e quimiocinas (UNDERHILL e GOODRIDGE, 2012).

Em in vitro foi avaliado a capacidade fagocítica dos macrófagos na presença de diferentes concentrações dos extratos de A. brasiliensis e I. paraguariensis. Nossos dados mostraram que o A. brasiliensis reduziu a capacidade fagocítica de macrófagos, enquanto o I.

paraguariensis aumentou esta capacidade fagocítica. Contrariamente aos nossos dados, outros

estudos mostraram que o A. brasiliensis foi capaz de aumentar a capacidade fagocítica na presença de Candida albicans (FUJIMYA et al. 1998; MIYAGAWA, 2013) dependente da concentração (NAVEGANTES et al. 2013).

Nesse sentido, Martins (2008) mostrou que PBMC incubado com o A. brasiliensis apresentou maior capacidade fagocítica frente a C.albicans, no entanto quando estas células foram tratadas com anti-TRL2 e anti-TRL-4 houve uma redução significativa nesta atividade, sugerindo que esses receptores podem estar envolvidos na atividade fagocítica induzida pelo cogumelo. De maneira similar, Snriderle et al. (2013) mostraram que macrófagos peritoneais estimulados com LPS e tratados com 16-β-glucana proveniente de A. brasiliensis apresentaram redução da ativação dos macrófagos induzido pelo LPS, sugerindo que o polissacarídeo competiu com o LPS pelo receptor TLR-4. Dessa forma, tais dados explicam os nossos dados, sugerindo que os polissacarídeos do cogumelo possam competir com as partículas de zymosan pelos receptores TLR, tornando possível a inibição da atividade fagocítica pelo cogumelo. Além dos receptores TRL, também estão envolvidos no mecanismo da fagocitose os receptores Fc e Dectina-1, que é um receptor β-glucano, responsável pelo reconhecimento da parede celular do zymosan (STUART e EZEKOWITZ, 2005; UNDERHILL e GOODRIDGE, 2012).

Nas células tratadas com I.paraguariesis, a capacidade fagocítica aumentou significativamente de maneira dose-dependente. Na literatura não há relatos da atividade fagocítica do extrato de I. paraguariensis. Entretanto, sabe-se que o I. paraguariensis é rico em polifenóis e vários estudos mostram a ação imunomoduladora destes compostos (CUEVAS et al. 2013). Um estudo realizado por Monobe et al. (2010) mostraram que os polifenóis, especificamente o pirogalol, interferiu na atividade fagocítica de macrófagos. O pirogalol pode ser encontrado a partir da degradação dos ácidos fenólicos durante um tratamento térmico da erva-mate (VALDUGA; FINZER; MOSELE, 2003).

Durante a infecção na sepse, para restringir os agentes patogênicos pode ocorrer uma resposta inflamatória sistêmica exacerbada, com produção de citocinas pró-inflamatórias e

produção de espécies reativas, processo conhecido como “burst oxidativo” (ALONSO de

VEGA et al. 2002; CHIA-CHANG et al. 2005). O óxido nítrico é uma dessas espécies, e desempenha um papel crucial na defesa do hospedeiro frente a estes micro-organismos. No entanto o excesso de produção de NO tem implicado no surgimento de várias doenças e lesão dos órgãos (BEJAMIN et al. 2002).

Macrófagos peritoneais tratados com o extrato aquoso de A. brasiliensis nas primeiras 24 horas, tiveram aumento na produção de NO em todas as concentrações testadas. O mesmo foi observado por Sorimachi et al. (2001), em que mostraram que in vitro os corpos frutífERO do cogumelo induziram a secreção de NO por macrófagos derivados de ratos. Quando as células foram estimuladas com o LPS, o A. brasiliensis foi capaz de diminuir os níveis de NO in vitro. Nesse sentido, Zhu et al. (2011) mostraram que o polissacarídeo beta-glucana administrado por gavagem em ratos foi capaz de reduzir a expressão da iNOS. Além disso, estudos anteriores do nosso grupo mostraram que macrófagos peritoneais estimulados com o mitógeno Con A e tratados com A. brasiliensis também apresentaram redução dos níveis de NO (NAVEGANTES et al. 2013).

O extrato de I. paraguariensis, aumentou os níveis de óxido nítrico em macrófagos peritoneais. Esta atividade que pode ser atribuída aos polifenóis, como a quercetina (PIGNATELLI et al. 2006), haja vista que já é relatado na literatura que os polifenóis estimulam a formação de NO, por meio do aumento da fosforilação da enzima NOS (LUNDBERG et al. 2015).

As células quando estimuladas com LPS e tratado com I. paraguariensis, apresentaram redução nos níveis de NO. O mesmo foi relatado por Puangpraphant e Mejia (2009), em que macrófagos humanos ativados por LPS na presença do extrato de I. paraguariensis apresentaram inibição da resposta pró-inflamatória com bloqueio da COX-2 e inibição do NO e citocinas pró-inflamatórias. Outro estudo realizado por Schinella et al. (2005) mostrou que o extrato aquoso de erva-mate foi capaz de diminuir os níveis de NO em ratos com disfunção cardíaca (SCHINELLA et al. 2005).

No presente estudo, também foi avaliado o efeito proliferativo em esplenócitos murinos. Os dados mostraram que o tratamento com o cogumelo induziu efeito proliferativo de esplenócitos. O mesmo foi observado em nossos estudos anteriores (NAVEGANTES et al. 2013) e por Chan et al. (2007). Segundo Hashimoto et al. (2006), o cogumelo A. brasiliensis, além de polifenóis possui polifenol-oxidase e peroxidase, que são enzimas que interagem com os compostos fenólicos originando polifenóis polimerizados de alto peso molecular, que seriam responsáveis por algumas atividades biológicas. Nesse contexto, Yamanaka et al. (2012)

mostraram que esses polifenóis polimerizados são capazes de induzir a proliferação de esplenócitos murinos.

Por outro lado, alguns estudos mostram que células estimuladas com Con A e tratadas com A. brasiliensis exibiram efeito antiproliferativo. Tsai et al. (2013) mostraram que o cogumelo teve efeito antiproliferativo em mononucleares do sangue periférico humano estimuladas com fitohemaglutinina. Esse efeito foi observado também em células cancerígenas, efeito atribuído a beta-glucana e ao Agarol, um ergosterol presente no A. brasiliensis (TAKAKU et al. 2001; SHIMIZU et al. 2016) devido a parada do ciclo celular (HSIAO et al. 2007).

Os dados mostram que o tratamento com I. paraguariensis em células estimuladas com o ConA levou à um efeito antiproliferativo de maneira dose-dependente. Também não há relatos na literatura sobre esta atividade antiproliferativa em esplenócitos, entretanto este efeito foi relatado frente às células cancerígenas (BOAVENTURA et al. 2015).

Durante a sepse ocorre uma excessiva produção de radicais livres (CHERIAN et al. 2007), sendo assim foi avaliada a capacidade antioxidante dos extratos aquosos de A.

brasiliensis e I. paraguariensis. Os dados mostram que o extrato de A. brasiliensis apresentou

excelente atividade antioxidante pelo método de ABTS e sequestro de DPPH. De maneira similar, Carvajal et al. (2012), mostraram a excelente capacidade antioxidante do extrato de A.

brasiliensis, principalmente do corpo de frutificação e da massa micelial, através do sequestro

de DPPH, ABTS e a capacidade de quelar Fe++_{. Além disso, Gan et al. (2013) comprovaram a}

atividade antioxidante de compostos fenólicos em extratos etanólicos de A. brasiliensis e à outros componentes antioxidantes presentes em extratos aquosos deste cogumelo, enquanto que Mourão et al. (2011) relataram que β-glucanas são as principais responsáveis pela atividade antioxidante.

Quanto ao extrato de I. paraguariensis, os dados mostraram que este extrato apresentou notória atividade antioxidante. Nossos resultados estão de acordo com a literatura, em que a atividade antioxidante já é amplamente relatada em modelo in vitro e in vivo. Nesse contexto, Gugliucci e Stahl (1995) mostraram a capacidade do extrato de I. paraguariensis em inibir a oxidação da lipoproteína de baixa densidade in vitro. Assim como, Schinella et al. (2000) mostraram a capacidade deste extrato em inibir a peroxidação lipídica em microssomas de fígados de ratos. A atividade de erva-mate é atribuída principalmente aos compostos fenólicos (BASTOS et al. 2007).

O excesso de espécies reativas pode oxidar os componentes celulares e inibir as funções fisiológicas além de dano celular como já foi mencionado anteriormente (VALKO et al. 2007).

O método comumente utilizado para detectar essas espécies é o DCFH-DA. Este composto é capaz de penetrar na membrana celular onde o é hidrolisado em DCFH, que por sua vez reage com ERO gerando DCF, e seu aumento indica presença de radicais intracelulares (HUANG et al. 2014). Nosso estudo mostrou que o A. brasiliensis foi capaz de inibir a produção de ERO induzida pelo oxidante tBHP. Esses dados estão de acordo com Huang et al. (2014), em que o extrato metanólico de A. brasiliensis inibiu significativamente a liberação de ERO e aumentou a viabilidade celular comparada às células que somente tiveram dano induzido pelo peróxido de hidrogênio. Angeli et al. (2006) mostraram que a β-glucana de A. brasiliensis protegeu os linfócitos humanos de ERO, impedindo o dano ao DNA. Estes polissacarídeos podem atuar na varredura de radicais superóxido, hidroxila e inibindo a peroxidação lipídica (CASTRO et al. 2014).

As células que foram tratadas com o extrato aquoso de I. paraguariensis na presença do oxidante, também tiveram uma redução significativa da liberação de ERO. Tamura et al. (2013) também mostrou esse efeito ao tratar hepatócitos que sofreram oxidação pelo etanol com extrato de erva-mate, onde estas células apresentaram níveis basais de ERO após o tratamento. A literatura mostra que o consumo de erva-mate está associado à diminuição da peroxidação lipídica e aumento da expressão gênica de enzimas antioxidantes (glutationa peroxidase, superóxido dismutase e catalase) (MATSUMOTO, 2009).

Após todos os testes in vitro, foi avaliado o efeito dos extratos em modelo de sepse em murinos induzida pelo método CLP. O CLP, é considerado o modelo padrão-ouro para a investigação da sepse in vivo, pois se trata de um procedimento simples e se assemelha à progressão e às características da sepse humana (DEJAGER et al. 2011). O CLP em camundongos reproduz uma série de características chave da peritonite bacteriana secundária em seres humanos, incluindo a infecção polimicrobiana, (OZMENT et al. 2012; SIEMPOS et al. 2014), características hemodinâmica, com a presença das fases hiper-inflamatória e de imunossupressão (HOLLENBERG et al. 2001; DOERSCHUG et al. 2004; DEJAGER et al. 2011).

A técnica envolve uma laparotomia mediana no abdome do animal, com a exteriorização do ceco e a ligadura distal à válvula e posteriormente a perfuração da região ileocecal. Este processo cria uma perfuração do intestino com o vazamento dos conteúdos fecais no peritônio, o qual estabelece uma infecção com uma flora bacteriana mista e fornece uma

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