Na etapa anterior, foram empregados como matrizes para imobilização por adsorção física de lipases suportes disponíveis comercialmente e de alto custo tais como octadecil-sepabeads, hexil-toyopearl e octil-agarose. Como suporte alternativo, foi empregado poli-(hidróxi-butirato), uma matriz altamente hidrofóbica e de baixo custo, ideal para a imobilização de lipases. Foram adquiridas duas configurações de PHB, nas formas de grânulos e em pó. Lipases microbianas disponíveis comercialmente como CALB, LTL, LPF e Lipex® 100L e a lipase obtida por fermentação no Laboratório de Controle de Processos (DEQ-UFSCar) BTL2 (B. thermocatenulatus) foram imobilizadas em PHB, conforme metodologia descrita por Bastida et al. (1998) e apresentada no item 3.2.8.2. O procedimento de imobilização se baseia na interação hidrofóbica do “lid” da enzima com o suporte em baixa força iônica. Foram empregados carregamentos de 5 mg de proteína.g-1 de gel para as lipases disponíveis comercialmente e carregamento de 10 mg.g-1 de suporte para a lipase obtida por fermentação. As propriedades catalíticas dos derivados obtidos estão sumarizadas na Tabela 4.26.
As lipases CALB, LTL e Lipex® 100L foram completamente imobilizadas em PHB nas formas em pó e granular. Isto mostra que nestas preparações há somente lipase, ou seja, as condições empregadas na imobilização somente as lipases são imobilizadas e impurezas presentes nas amostras permanecem no sobrenadante final. Esta estratégia de imobilização por adsorção hidrofóbica é muito empregada na literatura para a purificação de preparações de lipases comerciais e obtidas por fermentação em escala laboratorial (Bastida et al., 1998; Palomo et al., 2002; Palomo et al., 2005). Para estas três preparações de lipases verifica-se que a geometria do suporte não influenciou no processo de imobilização. Porém para a lipase LPF a geometria do suporte teve uma forte influência. Aproximadamente 80% da atividade hidrolítica oferecida foi imobilizada em PHB em pó e para o suporte na forma de
151 grânulos, o rendimento de imobilização foi próximo a 60%. A lipase de Bacillus thermocatenulatus (BTL2), obtida por fermentação, foi completamente imobilizada em PHB, ou seja, após a imobilização não havia atividade hidrolítica no sobrenadante final. Este comportamento não foi verificado para esta mesma lipase imobilizada no suporte granular que apresentou aproximadamente 70% de rendimento de imobilização. Neste caso pode-se notar também a influência da geometria do suporte, similar à lipase LPF.
Tabela 4.26. Parâmetros de imobilização de lipases de diferentes fontes em PHB em pó e granular. Parâmetros de Imobilização Lipase PHB RI (%) PI (%) AHder. (U.g-1 de suporte) AR (%) Pó 100 ~100 135,5 25,8 CALB Granular 100 ~100 43,0 10,8 Pó 100 ~100 1558,1 65,4 LTL Granular 100 ~100 200,0 11,1 Pó 100 ~100 1717,5 82,2 Lipex® 100L Granular 100 ~100 190,2 9,10 Pó 78,7 77,2 1099,6 80,4 LPF Granular 59,4 56,2 212,8 22,5 Pó 100 73,6 256,6 31,5 BTL2 Granular 67,2 50,4 69,6 7,80
RI: Rendimento de imobilização (atividade hidrolítica desaparecida do sobrenadante durante a imobilização) (%); PI: Proteína imobilizada (%); AHder.: Atividade hidrolítica do derivado (U.g-1 de suporte); AR: Atividade
recuperada (%)
Para as preparações comerciais CALB, LTL e Lipex® 100L aproximadamente toda a proteína oferecida foi completamente imobilizada, mostrando que a concentração de proteínas contaminantes foi desprezível. Os valores de proteína imobilizada de LPF em PHB foram similares aos valores de rendimento de imobilização, mostrando que a pequena diferença entre rendimento de imobilização e proteína imobilizada se deve à presença de contaminantes contidas nesta preparação enzimática, porém em pequena quantidade (Palomo et al., 2004; Palomo et al., 2005). Para a lipase BTL2 imobilizada em PHB em pó, a porcentagem de enzima imobilizada foi em torno de 75% do carregamento oferecido (10
152 mg.g-1 de suporte). Como no sobrenadante final não havia atividade lipásica, pode-se afirmar que aproximadamente 25% da proteína inicialmente oferecida na imobilização era composta de proteínas contaminantes oriundas do processo de ruptura celular ou de enzimas contaminantes presentes no interior da célula, pois a lipase de BTL2 é uma enzima intracelular. Para a lipase imobilizada em PHB granular, a porcentagem de proteína imobilizada foi próxima a 50%, mostrando a influência da geometria do suporte.
O tamanho de partícula é muito importante para a atividade enzimática, pois a área superficial da matriz está intimamente relacionada com a atividade catalítica da enzima. Os parâmetros de imobilização que obtiveram maior influência da geometria do suporte foram a atividade hidrolítica e, consequentemente, a atividade recuperada. As lipases imobilizadas em PHB em pó apresentaram valores de atividades hidrolíticas bastante superiores aos derivados de PHB granular. Os maiores valores de atividade hidrolítica foram obtidos para Lipex® 100L (1717,5 U.g-1), LTL (1558,1 U.g-1) e LPF (1099,6 U.g-1) imobilizadas em pó e os valores respectivos de atividade recuperada foram de 82,2, 65,4 e 80,4%. As lipases mais afetadas pela geometria do suporte foram as preparações enzimáticas Lipex® 100L, LTL e LPF, com drástica redução da atividade catalítica da enzima de nove, oito e cinco vezes, respectivamente. De acordo com a literatura, a geometria do suporte exerce uma influência bastante significativa sobre a atividade catalítica da enzima visto que suportes com maior área superficial tendem a aumentar o acesso do substrato aos sítios ativos da enzima. Para as lipases CALB e BTL2, a atividade catalítica dos derivados de PHB em pó foram três a quatro vezes maiores que as dos derivados de PHB granular.
Foi realizada também a síntese do éster butirato de butila para determinar a atividade sintética destes derivados, conforme mostrado na Tabela 4.27. Foi verificada que a conformação do suporte não influenciou no rendimento de esterificação. É importante salientar que a atividade hidrolítica estimada foi realizada empregando azeite de oliva emulsificado e para a atividade de síntese a formação do butirato de butila, substratos muito distintos quanto ao tamanho da cadeia carbônica. Os rendimentos de esterificação foram superiores a 90% para todos os derivados com exceção dos derivados de BTL2 que oscilaram entre 80 a 90%.
153 Tabela 4.27. Síntese de butirato de butila catalisada por lipases imobilizadas por adsorção física em PHB em pó e granular.
Lipase PHB Butirato de Butila
(mM)24 h Pó 95,0 CALB Granular 91,5 Pó 95,0 LTL Granular 94,6 Pó 93,7 Lipex® 100L Granular 94,3 Pó 93,0 LPF Granular 90,1 Pó 89,0 BTL2 Granular 82,8