O rendimento de transesterificação foi definido como o valor que expressa a massa total obtida de ésteres de etila (Mt) em relação a massa teórica esperada de ésteres de
etila (Me). Me foi determinada a partir da massa de ácidos graxos presente na massa inicial do
óleo vegetal (babaçu ou palma) (M0), da massa molecular correspondente a cada ácido (MMa)
e do éster correspondente (MMe). Este cálculo é representado pela Equação 3.12a, em que M0
corresponde ao produto da concentração mássica de cada ácido graxo (Ca), com a massa
inicial de óleo utilizada (Mi) (Equação 3.12b). O rendimento foi calculado utilizando a massa total de ésteres obtida pela análise por cromatografia gasosa (Mt) pela massa teórica de ésteres de etila (Me), conforme mostrado na Equação 3.12c.
MMa MMe Mo Me=( . ) (a) Mo=Ca.Mi (b) (c) .100 Me Mt R = (3.12) 3.2.16. Cálculo da Produtividade
O cálculo da produtividade foi realizado pela relação da massa de biodiesel produzido pelo tempo de reação e a massa de enzima imobilizada empregada na transesterificação, conforme mostrado pela equação 3.13.
PI biodiesel
m
t
m
P
.
=
(3.13)Em que: P é a produtividade (mgbiodiesel.h-1.mgPI); mbiodiesel é a massa de biodiesel produzida na
reação (mg); t é o tempo de reação (h) e mPI é a massa de proteína imobilizada empregada na
79 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste capítulo serão apresentados e discutidos os resultados experimentais obtidos neste trabalho. Conforme proposto inicialmente, foram preparados diferentes derivados imobilizados de lipases, variando-se a fonte da enzima, o procedimento de imobilização (covalente ou adsorção física), o tipo de suporte, a ativação destes suportes e as condições de imobilização, visando obter derivados estáveis e ativos para mediar a síntese de biodiesel a partir dos óleos de babaçu e de palma pela rota etílica. Estes derivados foram inicialmente caracterizados quanto à concentração de lipase imobilizada, atividade da enzima imobilizada, conversão em butirato de butila, atividade recuperada medida na hidrólise de azeite de oliva e estabilidade térmica.
Foram estudados seis tipos de preparações de lipases oriundas de fonte microbiana, incluindo Thermomyces lanuginosus (LTL), Pseudomonas fluorescens (LPF), Candida antarctica do tipo B (CALB), Lipex® 100L (fonte não informada) e Bacillus thermocatenulatus (BTL2) e de tecido de células animais como lipase de pâncreas de porco (LPP).
Essas enzimas foram imobilizadas covalentemente nos suportes orgânicos agarose 6BCL, agarose 10BCL, sepabeads, complexos polieletrolíticos de quitosana: quitosana pura, quitosana-alginato, quitosana-PVA, quitosana- -carragenina e quitosana- gelatina, modificados ou não quimicamente com TNBS, quitosana-alginato modificada com laurinaldeído e amino-toyopearl, ativados com glicidol, epicloridrina e glutaraldeído.
Além da imobilização covalente multipontual em suportes macroporosos, foi também testada a imobilização das lipases por adsorção física nas matrizes hidrofóbicas octil- agarose 4BCL, hexil-toyopearl, octadecil-sepabeads e poli-hidróxibutirato (PHB), este último nas formas em pó e granular. Os resultados dos testes de imobilização covalente são apresentados no item 4.1 e os da imobilização por adsorção apresentados no item 4.2. No item 4.3 é apresentado um quadro comparativo das propriedades de todos os derivados enzimáticos preparados, destacando as possíveis aplicações para os diferentes derivados. Baseando-se nessa discussão, foram selecionados os derivados mais estáveis termicamente para serem testados na etanólise de óleos vegetais. Finalmente, no item 4.4 são apresentados e discutidos os resultados obtidos na síntese de biodiesel com os derivados selecionados.
80 4.1. Imobilização Covalente Multipontual de Lipases em Suportes previamente Ativados 4.1.1. Suporte Agarose 6BCL: Imobilização de Lipase de Pâncreas de Porco (LPP) em Gel de Agarose 6BCL
A literatura indica que agarose é o suporte que fornece o maior aumento na estabilidade térmica do derivado imobilizado devido à sua grande área superficial, regularidade dos poros e excelente congruência geométrica com a proteína (Tardioli, 2003 a,b). Contudo, isso somente ocorre se a imobilização for realizada em pH superior a 10, pois a formação de várias ligações entre a enzima e o suporte requer que vários grupos amino da proteína estejam desprotonados e, portanto, disponíveis para reagir com os grupos aldeídos do suporte. Resíduos lisina, normalmente abundantes na superfície da enzima, são responsáveis pela formação de enlaces com o suporte, mas como possuem pKa em torno de 10,5, só estarão disponívies para a reação em pH superior a 10.
A primeira preparação enzimática testada foi a lipase de pâncreas de porco (LPP). Essa preparação enzimática possui um custo relativamente inferior às outras lipases por conter em sua formulação enzimas contaminantes tais como colesterol esterase, proteases (tripsina e quimotripsina) e outras hidrolases (Kazlauskas e Bornscheuer, 1998).
A imobilização da LPP em agarose ativada foi conduzida em tampão bicarbonato pH 10,05, oferecendo-se 5,00 mg de proteína.g-1 de gel (item 3.2.8.5). A ativação do suporte com glutaraldeído promoveu maior rendimento de imobilização (4,4 mg proteína desaparecida do sobrenadante) do que as ativações glioxil, com glicidol e epicloridrina (~2,00 mg de proteína). Entretanto, os derivados obtidos não apresentaram atividade hidrolítica devido à baixa estabilidade da enzima no pH de imobilização. A enzima incubada em tampão bicarbonato pH 10,05 foi totalmente inativada após 5 h de incubação, mostrando que essa preparação enzimática possui baixa estabilidade em pH de imobilização (10,05), como mostrado na Figura 4.1. Algumas estratégias foram empregadas para proteger o sítio ativo da enzima, reduzindo a inativação pelo pH altamente alcalimo, tais como adição à solução de enzima de íons cálcio, polietilenoglicol (PEG-1500), ácido butírico, glicerol, Triton X-100 e íons cálcio com estabilizante PEG-1500, segundo indicações descritas nos trabalhos publicados por Sharma et al. (2001) e Soares et al. (2003). Contudo, o perfil de inativação da LPP na presença ou ausência desses agentes estabiilizantes foi bastante similar.
81 Desta forma, foi testada outra estratégia, verificando, o tipo de tampão, sendo utilizado o tampão borato em pH 10,05 (50 mM). A enzima incubada neste tampão mostrou- se mais estável, inativando-se completamente somente após 10 h de incubação. Entretanto, trabalhos relatados na literatura mostram que esse tampão também não é indicado para imobilizar multipontualmente enzimas em géis glioxil, pois os íons borato podem formar complexos com os grupos glioxil do suporte, o que impede as multi-interações entre enzima e suporte (Álvaro et al., 1990).
0 2 4 6 8 10 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 A tividade Relat iva Tempo (h)
Figura 4.1. Estabilidade alcalina da lipase LPP em tampão bicarbonato pH 10,05 (□) e em tampão borato (■).
Desta forma, não foi possível obter derivados de LPP com atividade catalítica imobilizada em gel glioxil-agarose devido à sua baixa estabilidade em pH alcalino. A imobilização de LPP por ligação covalente somente pode ser realizada sem perda significativa de atividade em pH próximo à neutralidade (Desai et al., 2006; Paula et al., 2007).
4.1.2. Suporte Agarose 6BCL: Imobilização de Lipases Microbianas (LTL, LPF, Lipex®