Militser

A identificação e o mapeamento do sítio ativo na estrutura do alvo biológico é o principal objetivo na preparação para a triagem virtual por ancoragem molecular. Utilizando o programa NCS foi obtido o alinhamento das sequências de aminoácidos das macromoléculas alvo e calculados perfis de contato, denominados como fingerprints de contato que foram utilizados na seleção dos sítios ativos. A abordagem de análise simultânea de centenas de complexos ligante-alvo codificados em sequências de aminoácidos torna ágil a análise de informação em grande escala para determinação do sítio de ligação.

O software NCS, foi construído no Núcleo de Estudos em Quimioinformática (NEQUIM) e realiza de forma automatizada o alinhamento das sequencias de aminoácidos dos arquivos pdb utilizando o software LPC que também realiza o cálculo dos contatos com ligantes ativos disponíveis nos arquivos pdb estudados.

O software Ligand Pocket Contacts (LPC) calcula as distâncias entre os átomos, a superficie de contato entre os mesmos e prevê o tipo de interação entre as moléculas participantes da interação e dispõe na forma de fingerprints de contato (Sobolev, 1999).

O fingerprint de contato gerado apresenta seis bits para cada aminoácido. Estes bits correspondem à ocorrência de contato via cadeia lateral, ligação de hidrogênio, contato hidrofóbico, contato aromático e contato desestabilizante. Através da Figura 4.1 (página 44) é exemplificada a sequência de informações dispostas nos fingerprints de contato.

Os fingerprints de contato apresentam uma grande vantagem pois possibilitam a análise e identificação das regiões relacionadas aos sítios de ligação sem a necessidade de análise gráfica que apresenta maior custo computacional e de tempo do operador. Os fingerprints de contato possibilitam o ordenamento e classificação de grande número de arquivos pdb que são agrupados ou utilizados em outras análises.

44 Figura 4.1 – Sequenciamento de informações dispostas nos fingerprints de contato (Manual

do software NCS)

Os complexos ligante-alvo utilizados na construção dos fingerprints de contato são modelos de estruturas químicas obtidas com o auxílio da ressonância magnética nuclear ou cristalografia por difração de raios-X. Foram considerados como ligantes ativos somente os compostos químicos comprovadamente ativos frente aos alvos estudados ou em casos restritos são incluídos compostos que participam da reação promovida pelo receptor como é o caso, por exemplo, de ATP e NADP em mecanismos ATP ou NADP dependentes

O NCS utiliza o software ClustalX para realizar múltiplos alinhamentos dos fingerprints de contatos, utilizando modelo estatístico de análise hierárquica de agrupamentos (contatos) (HCA) para separar em grupos de acordo com o perfil de interação dos pares ligante-alvo e da métrica matemática utilizada (Thompson, 1997; José, 2010).

Para realizar classificação dos fingerprints de contato, foi utilizada a análise hierárquica de agrupamentos (HCA) resultando em um dendograma que os agrupa por similaridade dos contatos utilizando como métrica a distância Euclidiana. Esta métrica foi utilizada por apresentar simplicidade de aplicação e melhores resultados na classificação de menor número de grupos. Na Equação 1 é apresentada a forma simplificada de estimação da distância Euclidiana, para pontos n-dimensionais (Montgomery, 2011).

Equação 4.1 – Estimação da distância Euclidiana para pontos n-dimensionais.







q

p

Onde: p1, p2, ..., pn e q1, q2, ..., qn são pontos e DE é a dist. Euclidiana entre eles.

Esta classificação possibilita identificar perfis diferentes de interação de ligantes ativos com o mesmo receptor e facilita selecionar arquivos pdb representativos de cada perfil,

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para a construção de modelos de sítio de ligação denominados “protomol” que serão

utilizados na ancoragem molecular de um mesmo receptor, através do software Surflex (Jain, 2007).

Após o alinhamento dos fingerprints de contato, foi realizada, através dos softwares NCS ou MeV4.1.1, a análise gráfica do alinhamento e classificação dos fingerprints de contato em grupos de similaridade (clusters). Foram selecionados de 4 a 15 arquivos, de acordo com o número de estruturas ligante-alvo disponíveis em arquivos PDB, para a geração dos modelos protomol dos sítios de ligação para a ancoragem molecular de cada alvo biológico estudado. Para cada arquivo pdb estudado para um mesmo alvo foi gerado um protomol que corresponde a região do sítio de interação ligante-alvo. Foram utilizadas as

configurações “default” do software Surflex, onde o parametro “proto_thresh” é configurado como 0.2 e “proto_bloat” configurado como zero (Holt, 2008). Proto_thresh determina o

quão longe o protomol se estende para dentro da concavidade do sítio de ligação, enquanto que o parâmetro "proto_bloat" representa o quão longe o protomol se estende para fora da concavidade do sítio de ligação (Holt, 2008).

O algoritmo Surflex-Dock aplica um método empírico de pontuação (Hammerhead) para gerar protomol com base na região de interação ligante-alvo (ligantes ativos) de cada um dos arquivos selecionados para um mesmo alvo. O protomol é o resultado do mapeamento das regiões favoráveis para interação com sondas moleculares específicas (resíduos de aminoácidos importantes na superfície dos sítios ativos). A ancoragem molecular foi realizada para todos os modelos protomol gerados para cada alvo selecionado frente a todos os compostos descritos no projeto e também para os compostos ativos descritos nas bases de dados apresentadas e utilizados na classificação dos contatos. Um referência sobre a abordagem de ancoragem molecular utilizada neste trabalho está disponível na página 167 (Anexo 1).

Foram avaliadas diversas substâncias reconhecidamente ativas frente aos alvos estudados e os índices de afinidade observados foram comparados com os resultados obtidos para cada um dos TTPCs friedelanos e lupanos estudados.

Na Figura 4.2 (página 46) é apresentado um modelo de mapa de contatos obtido pelo software NCS. Na Figura 4.3 (página 46) foi apresentada uma descrição necessária à identificação dos pares ligante-alvo avaliados através da análise hierárquica de agrupamentos (contatos) apresentada nos mapas de contato disponíveis no material adicional.

46 Figura 4.2 – Modelo de mapa de contatos da análise hierárquica de agrupamentos (HCA) de

contato obtido pelo software NCS (Fonte: manual do NCS).

Figura 4.3 – Representação, no mapa de contatos, do arquivo pdb e ligantes utilizados na análise hierárquica de agrupamentos (contatos) (HCA) pelo software NCS.

Um roteiro de preparação dos arquivos dos alvos até a geração dos modelos protomol é apresentado abaixo:

 Remoção das moléculas de água e íons (SO42- e íons metálicos) existentes nos aquivos.  Remoção do ligante ativo de cada arquivo.

 Adição dos hidrogênios (a representação nos arquivos pdb não apresentam os átomos de

hidrogênio).

 Cálculo das cargas para os diferentes átomos na estrutura da molécula (utilizando o software Molcharge).

 Geração do arquivo protomol (tendo como referência as interações ligante-alvo já

existentes no arquivo cristalográfico) para realização da ancoragem molecular.