Merkekjennskap

A próxima etapa foi a realização de modificações que permitissem que o pico referente à apramicina estivesse bem resolvido dos demais, fosse o mais simétrico possível e que tivesse um tempo de retenção reduzido em relação aos 22 minutos iniciais a fim de minimizar o tempo de análise. Essa etapa teve por objetivo, portanto, a adequação do sistema cromatográfico, que é feita através da avaliação de parâmetros como número de pratos teóricos, fator de cauda (tailing factor), fator de capacidade (k’) e principalmente a resolução. Quando um método está em fase de desenvolvimento, é essencial fazer modificações em suas condições de tal forma que estes parâmetros estejam dentro de limites adequados, o que assegura a qualidade da análise e, portanto, a confiabilidade dos resultados.[46,48,83]

De acordo com JENKE[88], a resolução (R), como a ferramenta mais importante para testar o desempenho cromatográfico, uma vez que se relaciona diretamente com a eficiência (N), a seletividade (α) e o fator de capacidade (k’). A resolução indica a eficiência de separação de dois componentes em uma mistura e, portanto, a qualidade da análise cromatográfica. Sua determinação é feita pela comparação da distância entre 2 picos vizinhos, calculada através do tempo de retenção e da largura do pico. Os picos não estão completamente separados quando a resolução é igual ou menor que 1, indicativo de picos sobrepostos; resolução de linha de base é

alcançada com valores iguais a 1,5; valores maiores indicam uma separação completa do pico de interesse dentre os demais. Uma das metas principais ao se desenvolver um novo método analítico por CLAE é assegurar a separação completa do composto de interesse dentre os demais com o menor tempo de análise possível.

O fator de capacidade (k’) é a medida do grau de afinidade que a substância apresenta para com a coluna e a fase móvel. O seu valor não deve ser muito pequeno, pois significa pouca interação do composto com a fase estacionária e/ou que a fase móvel é muito forte; por outro lado, seu valor também não pode ser muito grande pois significa que a fase móvel é muito fraca e/ou o soluto tem muita afinidade com a fase estacionária. [29, 41, 46]:

O fator de separação (α) permite caracterizar a distância de separação de dois picos consecutivos e é calculado a partir da comparação do fator de capacidade. [46]:

O número de pratos teóricos mede a eficiência da coluna, através do tempo de retenção obtido e da largura do pico. Quanto maior esse número, mais indicado é o empacotamento da coluna para a análise em questão, o comprimento da coluna é longo o bastante e a condição de fluxo da fase móvel é adequada. [46]

O fator de simetria (T) permite verificar a proximidade do pico cromatográfico com a forma gaussiana. Quando a assimetria é acentuada, ocorre a formação dos picos com caudas. Quando o fator de assimetria é menor que um, esta cauda é frontal. A assimetria dos picos pode interferir na precisão da metodologia, pois a altura ou a área do pico assimétrico não está linearmente relacionada com a concentração da substância analisada. [29,41,46]

Para a otimização das condições cromatográficas do método em desenvolvimento para a análise de apramicina, foram realizadas algumas injeções exploratórias com modificações na composição da fase móvel e uso de dois tipos diferentes de coluna, além da coluna que vinha sendo empregada, a Gemini C18 250 mm x 4,6 mm x 5 µm, conforme poderá ser visualizado na Tabela 8. Em cada modificação efetuada foi feita uma injeção da solução padrão de apramicina previamente derivatizada conforme descrito no item 4.2.1.2, porém, após 90 minutos de reação, em vez de 35 minutos iniciais, para garantir que a reação fosse completa com todo o OPA contido no meio e que, desta forma, se minimizasse a interferência de possíveis produtos secundários indesejados provenientes de reações parciais do OPA com alguma das 4 aminas primárias. As demais condições cromatográficas permaneceram as mesmas descritas em 4.2.1.4.

Enquanto a Tabela 8 traz as modificações efetuadas na composição da fase móvel e o tipo de coluna empregado em cada injeção, a Tabela 9 traz os resultados obtidos para os parâmetros de adequação de sistema avaliados em cada caso.

Tabela 8. Variações realizadas na composição da fase móvel e do tipo de coluna empregada para os testes de adequação do sistema cromatográfico

Injeção Coluna

Fase Móvel

% ACN % Sol. Pic B8 Fluxo (mL/min)

1 Gemini C18 - 250mm x 4,6 mm, 5µm 40 60 1,0 2 Gemini C18 - 250mm x 4,6 mm, 5µm 50 50 1,0 3 Zorbax C18 - 250mm x 4,6 mm, 4µm 50 50 1,0 4 Synergi Hidro C18 - 150 mm x 4,6 mm, 4 µ m 45 55 1,0

Tabela 9. Resultados obtidos para os parâmetros de adequação do sistema cromatográfico em função das diferentes condições empregadas (coluna e/ou composição da fase móvel) em cada injeção Injeção Pico da Apramicina Tempo de Retenção (min)

Área Resolução Fator de Simetria (T) Fator de Capacidade (k) Número de Pratos Teóricos 1 22,887 9.610.895 1,76 1,97 10,42 3959,46 2 13,050 13.558.189 1,60 1,91 4,22 3104,00 3 17,080 340.736 2,48 1,08 7,54 3281,82 4 11,660 7.394.057 2,76 1,44 5,14 3443,00

As Figuras 6, 7 e 8 a seguir ilustram os resultados obtidos nas injeções 2, 3 e 4 citadas nas tabelas anteriores.

Figura 6. Perfil cromatográfico de solução padrão teste de apramicina derivatizada com solução de OPA- Injeção 2. Condições. Cromatográficas: fase móvel - solução Pic B8 e acetonitrila (50:50 v/v); fluxo - 1,0 mL/min; coluna – Gemini C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm), temperatura ambiente; detecção – fluorescência (exc. 230nm; em. 390 nm); volume de injeção - 50 µ L

Figura 7. Perfil cromatográfico de solução padrão teste de apramicina derivatizada com solução de OPA – Injeção 3. Condições. Cromatográficas: fase móvel - solução Pic B8 e acetonitrila (50:50 v/v); fluxo - 1,0 mL/min; coluna – Synergi FusionC18 (250 mm x 4,6 mm x 4 µm), temperatura. ambiente; detecção – fluorescência (exc. 230nm; em. 390 nm); volume de . injeção - 50 µL

Figura 8. Perfil cromatográfico de solução padrão teste de apramicina derivatizada com solução de OPA – Injeção 4. Condições Cromatográficas: fase móvel - sol. Pic B8 e acetonitrila (55:45 v/v); fluxo - 1,0 mL/min; coluna – Synergi Hidro C18 (150 mm x 4,6 mm x 4 µm), temperatura ambiente; detecção – fluorescência (exc. 230nm; em. 390 nm); volume de injeção - 50 µL

Analisando-se todos os resultados obtidos com base no que foi exposto sobre a importância dos critérios de adequação do sistema cromatográfico, sobretudo no que se refere à resolução, e nos objetivos pretendido de redução do tempo de retenção do pico da apramicina, a condição mais apropriada para se trabalhar foi aquela na qual se empregou fase móvel composta de 45% de acetonitrila e 55% de solução de Pic B8 num fluxo de 1,0 mL/min utilizando-se a coluna Synergi Hidro C18, 150 mm x 4,6 mm x 4 µm, a qual proporcionou bons valores de resolução, fator de capacidade, fator de cauda e de número de pratos teóricos e, sobretudo, menor tempo de retenção para o pico da apramicina (cerca de 11 minutos).

Decidiu-se, portanto, prosseguir com o desenvolvimento do método empregando-se essas duas novas condições de coluna e composição da fase móvel, permanecendo as demais condições cromatográficas inalteradas. Entretanto, a ocorrência de um problema com a solução de derivatização de OPA que vinha sendo empregada, fez com que os rumos do desenvolvimento do novo método fossem alterados, conforme será detalhado a seguir.