Main findings myalgia

O padrão ouro para o diagnóstico da PCM é a identificação do agente da doença por meio de exame microscópico direto em espécimes clínicos ou em cultura. A dificuldade na identificação das estruturas leveduriformes do fungo em exame direto pela necessidade de pessoal treinado e experiente, e o longo tempo para o crescimento das colônias do fungo sob cultivo, que pode atingir duas a três semanas, muitas vezes

atrasam o seu diagnóstico e o início do tratamento. Além disso, a taxa de isolamento do fungo em cultura a partir de espécimes clínicos pode variar de 86 a 100%. Esses fatores limitam a aplicação de técnicas de cultivo no diagnóstico de rotina da PCM (Almeida et al., 2003; Telles e Martins, 2011). A inoculação de espécimes clínicos infectados em animais suscetíveis à PCM também pode ser realizada, porém, esta prática é exclusiva de laboratórios de pesquisa para recuperação da virulência do fungo (Brummer et al., 1993).

Técnicas histopatológicas baseadas na marcação de estruturas morfológicas do fungo apresentam grande valor no diagnóstico da PCM. Em algumas situações o diagnóstico por histopatologia pode não ser a melhor opção, como no caso em que as estruturas marcadas em uma amostra não apresentam as características mais predominantes do fungo, e o examinador não tem muita experiência. Nessa situação, outros fungos como Histoplasma spp., Blastomyces dermatitidis ou Coccidioides immitis podem ser confundidos com o P. brasiliensis (Bialek et al., 2000; Telles e Martins, 2011). Na prática clínica, biopsias de lesões de pacientes analisadas por técnicas de histopatologia como as de Gomori-Grocott ou de ácido de Schiff são muitas vezes determinantes para o diagnóstico da PCM. De forma geral, nas técnicas histopatológicas são observadas a formação de granuloma com células gigantes multinucleadas e a presença de infiltrado polimorfonuclear contendo linfócitos, plasmócitos, eosinófilos e neutrófilos. Células leveduriformes em brotamento são visualizadas, cercadas por células ‘filhas’, formando uma estrutura típica do P. brasiliensis conhecida como ‘roda de leme’ (Ramos-e-Silva e Saraiva, 2008; Ameen et al., 2010).

As técnicas sorológicas utilizadas no diagnóstico da PCM são alternativa muitas vezes mais rápida e simples, comparadas aos exames parasitológicos. A detecção de

anticorpos específicos anti-P. brasiliensis permite, além do diagnóstico da doença, o acompanhamento de pacientes durante o tratamento, e após a sua interrupção (Marques, 2003; Ferreira, 2009). Os testes sorológicos mais usados para o diagnóstico da PCM são: imunodifusão dupla (ID), contraimunoeletroforese (CIE), imunofluorescência indireta (IFI), ensaio imunoenzimático (ELISA) e immunoblot (IB).

A ID é o teste indicado pelo Consenso em PCM para diagnóstico e monitoramento de pacientes com a doença devido a sua simplicidade na execução, baixo custo e elevada especificidade (Shikanai-Yasuda et al., 2006; Camargo, 2008). Entretanto, sua sensibilidade mais reduzida em comparação a outras técnicas, a impossibilidade de automação e a necessidade de elevados níveis de anticorpos para que seja detectada reatividade na técnica, fazem com que a ID seja pouco utilizada atualmente. No sistema público de saúde do estado de Minas Gerais praticamente não é possível a realização desse teste para diagnóstico de PCM.

A CIE é técnica de rápida execução, que apresenta bons resultados, com sensibilidade entre 77 e 100% e especificidade acima de 95%, o que possibilita sua aplicação segura no diagnóstico da PCM (Marques, 2003; Ramos-e-Silva e Saraiva, 2008). A CIE poderia ser o primeiro teste de triagem em soros de indivíduos com suspeita de PCM devido à rapidez com a qual os resultados podem ser obtidos. Entretanto, o tempo para realização do teste não difere muito em relação à ID, além disso, alguns de seus reagentes suplementados nem sempre estão disponíveis em laboratórios de áreas endêmicas (Camargo, 2008).

O IB apresenta elevadas sensibilidade e especificidade, entretanto sua aplicação na rotina diagnóstica é restrita devido à maior complexidade e alto custo na realização da técnica. Além da gp43, que é o antígeno imunodominante do P. brasiliensis, as frações de 70, 52, 43 e 20-21kDa apresentam alta reatividade com anticorpos IgG na

técnica de IB (Camargo et al., 1989). A aplicação de IB na captura de antígenos em fluidos corporais foi sugerida como metodologia promissora para diagnóstico, avaliação de eficácia de tratamento e detecção de recidivas (Marques, 2003).

A IFI é considerada técnica útil para diagnóstico e acompanhamento de pacientes com PCM. Apesar de não ser muito utilizada, pode apresentar especificidade de 90% e sensibilidade de 65%. Observa-se congruência na relação entre os resultados obtidos por IFI e a gravidade da PCM (Biagione et al., 1984; Del Negro et al., 1991).

A técnica de ELISA vem sendo amplamente utilizada para o diagnóstico da PCM e de outras micoses. Apesar de ser menos específica que a ID, devido às reações cruzadas que apresenta, possui sensibilidade próxima de 100%, especificidade em torno de 88%, rapidez, além de ser utilizada para avaliar grande número de amostras simultaneamente (Telles e Martins, 2011). Várias modificações têm sido feitas nessa técnica com o intuito de evitar reações cruzadas, e de aumentar a sua especificidade e sensibilidade. Um exemplo é a técnica de “ELISA-abs”, na qual é feita absorção prévia da amostra teste com filtrado antigênico de H. capsulatum, que demonstrou especificidade entre 97 e 100% (Camargo e Franco, 2000). Recentemente, as frações antigências rPb27 e rPb40 utilizadas em combinação na técnica de ELISA apresentaram excelentes resultados com elevadas sensibilidade e especificidade, demonstrando confiabilidade e reprodutibilidade para aplicação no diagnóstico da PCM (Fernandes et al., 2011).

A produção de anticorpos específicos na PCM é de forma geral eficiente, a não ser que haja imunossupressão. Nas formas agudas e disseminadas, os títulos de IgG anti-P. brasiliensis são mais elevados do que nos casos crônicos com doença localizada. Nestas formas, o resultado sorológico pode eventualmente ser falso-negativo (Brummer et al., 1993; Shikanai-Yasuda et al., 2006). Além disso, uma vez que os antígenos mais

utilizados nas técnicas sorológicas são produzidos a partir de espécies do fungo pertencentes ao grupo genético S1, caso as amostras avaliadas sejam provenientes de áreas onde a prevalência do fungo seja de outro grupo genético, poderá não haver reatividade (Telles e Martins, 2011).

As diferenças na virulência das cepas do fungo, as técnicas empregadas para seu cultivo e o modo de obtenção dos seus antígenos, podem interferir diretamente nos resultados dos testes sorológicos encontrados em diferentes regiões (Telles e Martins, 2011). A glicoproteína de 43kDa é o principal antígeno utilizado em testes sorológicos para detecção de anticorpos uma vez que esta fração antigênica é reconhecida pela grande maioria dos soros de pacientes infectados (Ramos-e-Silva e Saraiva, 2008). Apesar da especificidade de gp43 garantir quase 100% do reconhecimento dos casos de PCM, podem ocorrer reações cruzadas com soros de indivíduos com outras doenças como histoplasmose, lobomicose e aspergilose (Marques, 2003). Nas últimas décadas, a busca por novos antígenos aplicáveis no diagnóstico da PCM tem produzido muitos avanços com a identificação de frações antigênicas como gp70, gp75, hsp60, hsp87 e rPb27, que garantem alta especificidade nas técnicas sorológicas (Telles e Martins, 2011; Caldini et al., 2012). O desenvolvimento de técnicas que usam antígenos padronizados e específicos tem proporcionado resultados que alcançam 85 a 100% de sensibilidade e especificidade, garantindo mais segurança ao diagnóstico da PCM (Ferreira, 2009).

Deve ser ressaltado em relação ao diagnóstico sorológico da PCM, que resultados sorológicos das mesmas amostras podem variar quando diferentes técnicas são aplicadas, usando antígenos distintos. Isso demonstra a necessidade da busca pela padronização das técnicas sorológicas para aplicação na rotina laboratorial, considerando as diferenças nos perfis do P. brasiliensis procedentes de distintas regiões.

A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) constitui outra alternativa para o diagnóstico da PCM, ainda restrita a centros de pesquisa. A PCR é uma técnica rápida que apresenta altas sensibilidade e especificidade, e pode ser útil também no monitoramento de pacientes durante e após tratamento. A sua principal vantagem é a amplificação de quantidades mínimas de material genético do fungo em diferentes espécimes clínicos, sendo eficiente mesmo quando testes sorológicos e microscópicos são negativos. Entretanto, há dificuldade no desenvolvimento de primers específicos para o fungo, tornando ainda inviável a sua utilização na rotina laboratorial (Gomes et al., 2000; Ameen et al., 2010; Teles e Martins, 2011). A PCR pode apresentar resultados falso-positivos devido à contaminação e resultados falso-negativos, em consequência de má conservação da amostra e degradação do material genético do fungo.

A técnica de intradermorreação não tem valor para o diagnóstico de PCM ativa, entretanto, é muito aplicada em inquéritos epidemiológicos para identificação de indivíduos que já tiveram contato com o fungo. A intradermorreação pode utilizar diferentes tipos de antígenos, denominados paracoccidioidinas. A conversão de um paciente com doença grave, antes não reativo ao teste, e que se torna reativo durante o tratamento, é sinal de melhora da imunidade celular, o que sugere bom prognóstico (Brummer et al., 1993).