Analysis of data

As dosagens de marcadores inflamatórios por ensaio imunoenzimático (teste ELISA) foram realizadas no Laboratório de Imunofarmacologia do Instituto de Ciências Biológicas – ICB/UFMG, coordenado pelo Prof. Mauro Martins Teixeira, sob supervisão e orientação do Prof. Antônio Lúcio Teixeira Jr.

5.2.1 População estudada

O estudo imunológico foi realizado numa amostra de 26 pacientes do total de 75 atendidos no Ambulatório de Paracoccidioidomicose de março de 2001 a dezembro de 2006. Foram utilizadas amostras coletadas na ocasião do diagnóstico e após seis, 12 e 36 meses de tratamento.

Para comparação, foram recrutados 37 voluntários sadios pareados com os mesmos por idade. Todos os voluntários foram submetidos a anamnese e exame clínico detalhado para se excluir a presença de doenças como micoses subcutâneas ou sistêmicas, tuberculose, hanseníase, leishmaniose, doença de Chagas e doenças inflamatórias auto-imunes.

5.2.2 Critério de inclusão

Foram incluídos no estudo imunológico os pacientes do estudo clínico que tinham amostras de soro em pelo menos três das quatro ocasiões testadas (primeira consulta, seis meses, 12 meses e 36 meses). O total de 26 pacientes preencheu tal critério. Não foi realizado cálculo amostral para determinação do número de pacientes deste estudo; foi utilizada a amostra de conveniência.

5.2.3 Critério de exclusão e perdas

Foram excluídos do estudo imunológico os pacientes do estudo clínico que tinham duas ou menos amostras de soro devido a perdas por falhas na coleta, processamento ou armazenamento.

5.2.4 Processamento do sangue para obtenção do soro

O sangue foi coletado de forma asséptica em tubos de vácuo, sem anticoagulante. Logo após, foi centrifugado a 1.500 rpm, por 5 minutos. O sobrenadante (soro) foi, então, transferido para microtubos Eppendorf de 500 µL, em alíquotas de 200 µL. Essas alíquotas foram identificadas com as iniciais do paciente e a data da coleta e, em seguida, armazenadas a -70oC até a realização dos experimentos.

5.2.5 Dosagem de anticorpos IgG anti-P. brasiliensis (Pb) no soro

Os experimentos para dosagem sérica de anticorpos IgG contra antígenos somáticos de P. brasiliensis foram realizados através de testes ELISA no Laboratório de Imunologia Celular e Molecular do Departamento de Bioquímica e Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas – ICB/UFMG, coordenado pelo Prof. Alfredo Miranda

de Góes. Os resultados das dosagens são apresentados em densidade óptica

(Optical Density – OD) no comprimento de onda de 492 nm.

5.2.6 Processamento do soro para dosagem de IgG anti-Pb, sTNF-R1 e R2

As alíquotas de soro foram deixadas em temperatura ambiente, até descongelamento. O anticorpo de captura, na concentração fornecida pelo fabricante (DuoSet R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), foi diluído em PBS (solução salina com tampão fosfato – Phosphate Buffered Saline) e foi adicionado a cada poço da placa. Todas as placas foram deixadas durante a noite em geladeira, a 4oC. As alíquotas também foram deixadas na mesma temperatura durante esse intervalo, em tubos Eppendorf.

5.2.7 Processamento do soro para dosagem de quimiocinas

As alíquotas de soro foram deixadas em temperatura ambiente, até descongelamento. O excesso de proteínas foi removido por precipitação através da adição de sal e ácido, conforme realizado rotineiramente no Laboratório de Imunofarmacologia do Instituto de Ciências Biológicas – ICB/UFMG. Um volume de 200 µL de solução contendo ácido trifluoracético a 1,2% e cloreto de sódio (NaCl) a 1,35M foi adicionado a cada alíquota de soro. Após homogeneização, essas amostras foram deixadas por 7 minutos a temperatura ambiente e, em seguida,

centrifugadas a 10.000 rpm, a 4oC, por 10 minutos. O sobrenadante (300 µL) foi retirado e seu pH foi ajustado para 7,4.

O anticorpo de captura, na concentração fornecida pelo fabricante (DuoSet R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), foi diluído em PBS e adicionado a cada poço da placa. Todas as placas foram deixadas durante a noite em geladeira, a 4oC. As amostras preparadas também foram mantidas na mesma temperatura durante esse intervalo, em tubos Eppendorf.

5.2.8 Processamento das amostras para realização dos testes ELISA

Após incubação durante a noite, as placas foram lavadas quatro vezes com solução de Tween 20 (Sigma) a 0,05% em PBS. Em seguida, cada poço da placa foi bloqueado com BSA (albumina de soro bovino – Bovine Serum Albumine) a 10% em PBS e incubado por 1 hora em temperatura ambiente antes de ser submetido a nova lavagem, igual à anterior. As amostras foram adicionadas aos poços (100 µL/poço) e as placas foram deixadas durante a noite em geladeira, a 4oC.

No dia seguinte, as placas foram lavadas, conforme descrito, e o anticorpo de detecção, na concentração fornecida pelo fabricante, foi diluído em PBS e adicionado a cada poço. As placas, então, foram incubadas em temperatura ambiente por duas horas e, em seguida, novamente lavadas, conforme descrito acima.

A cada poço, foi adicionado como substrato cromogênico o reagente ο- fenilenediamina, e a placa foi deixada em recipiente escuro por tempo máximo de 15

minutos. Ao final desse período de repouso, a reação foi interrompida pela adição de ácido sulfúrico (H2SO4) a 1M a cada poço. A leitura foi realizada por um leitor de placas de ELISA em comprimento de onda de 492 nm (EMax Precision Microplate Reader, Molecular Devices, California, CA, USA). A transferência dos dados para o computador e sua análise foi feita pelo programa SoftMax Pro 5 (Molecular Devices, California, CA, USA).

Para dosagem de sTNF-R1 e sTNF-R2, foram utilizados kits de ELISA sanduíche (DuoSet R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) com limite de detecção de 5 pg/mL. Para a dosagem de CCL2, CCL3, CCL11 e CCL24 foram utilizados kits semelhantes, do mesmo fabricante, com limite de detecção de 10 pg/mL. Para a dosagem de CXCL9, foi utilizado kit de ELISA sanduíche com anticorpos pareados (Pharmigen, San Diego, CA, USA), com limite de detecção de 10 pg/mL.

5.3 Desenho do estudo

Trata-se de estudo prospectivo, descritivo e analítico. Foram acompanhados 75 pacientes adultos atendidos no ambulatório supramencionado, entre março de 2001 e dezembro de 2006. Foram estudadas as características clínicas e epidemiológicas desses pacientes e eles foram avaliados quanto à sua evolução e os possíveis fatores que influenciaram a mesma, tendo como variável dependente a “inatividade clínica”.

Para o estudo imunológico, foram utilizadas as amostras de soro de 26 dos pacientes, na ocasião do diagnóstico e após seis, 12 e 36 meses de tratamento. Para