Todos os casos analisados demonstraram imunorreatividade ao anticorpo utilizado. A expressão da proteína HIF-1α foi evidenciada através da marcação positiva nuclear e/ou citoplasmática em células endoteliais (Figuras 10). Em cada grupo de lesão estudado, calculou-se a porcentagem das células positivas através da contagem das células que apresentaram positividade e negatividade para o HIF-1α (Tabelas 2, 3 e 4).
Tabela 2. Percentuais médios do número de células positivas para a proteína HIF-1α na amostra de GP oral. CASO % (HIF-1α) 1 49 2 87 3 96 4 86 5 77 6 85 7 33 8 88 9 85 10 97 11 93 12 91 13 99 14 86 15 87 16 91 17 78 18 42 19 66 20 85 21 98 22 96 23 89 24 89 25 89 26 90 27 11 28 98 29 98 30 99 31 94 32 86 33 58 34 93 35 97 36 95 37 84 38 8 39 77 40 71
Tabela 3. Percentuais médios do número de células positivas para a proteína HIF-1α na amostra de HEM oral.
CASO % (HIF-1α) 1 77 2 57 3 95 4 73 5 95 6 83 7 78
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
Tabela 4. Percentuais médios do número de células positivas para a proteína HIF-1α na amostra de MV orais. CASO % (HIF-1α) 1 96 2 85 3 85 4 82 5 28 6 40 7 31 8 46 9 76 10 44 11 82 12 8 13 53
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
A análise da imunoexpressão do HIF-1α em relação às lesões revelou, para a lesão do GP maior mediana (87,5) para percentual das células positivas, seguido da lesão HEM (78) e MV (53) (Tabela 5). O teste não-paramétrico de Mann-Whitney revelou presença de diferença estatisticamente significativa entre as lesões GP e MV (p= 0,002) (Tabela 5).
Tabela 5. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75 e média dos postos para os percentuais de expressão da proteína HIF-1α entre as lesões categorizadas. Natal, RN-2012.
LESÃO N Mediana Q25-Q75 Média dos postos p(1)
HEM 7 78 73-95 28,07 <0.05*
GP 40 87,5 77-95 35,15
MV 13 53 35,5-83,5 17,5
(*): Diferença significante a 5,0%. (1): Teste Mann-Whitney.
Figura 5. Granuloma Piogênico. Fotomicrografia exibindo a superfície da lesão
composta por área de ulceração e um tecido conjuntivo fibroso frouxo com intenso
infiltrado misto permeado por numerosos vasos sanguíneos de calibres variados (H/E- 100x).
Figura 6. Granuloma Piogênico. Detalhe em maior aumento mostrando vasos sanguíneos
Figura 7. Hemangioma. F
a uma proliferação endote
Figura 8. Hemangioma. D
de células endoteliais (H/
. Fotomicrografia exibindo numerosos vasos associados otelial (H/E- 100x).
. Detalhe em maior aumento mostrando intensa prolifer H/E- 400x).
s
Figura 9. Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão da GLUT-1: A) Hemangioma;
Figura 10. Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão d HIF-1α: A) Granuloma
6. DISCUSSÃO
Por longo período de tempo não houve consenso em relação à terminologia e a classificação das lesões vasculares, dificultando a criação e a comparação de condutas de diagnóstico e tratamento destas lesões. Na atualidade, a classificação baseada no aspecto biológico é adotada internacionalmente, investigando a correlação entre comportamento biológico celular e evolução clínica. Em 1996, a ISSVA dividiu as lesões vasculares em duas categorias: tumores vasculares e malformações vasculares (ENJORAS; WASSEF; CHAPOT, 2009; GOLDENBERG, 2002).
Tumores vasculares são caracterizados por proliferação de células endoteliais, sendo incluídos neste grupo: os tumores vasculares benignos, como os HEMs, hemangioendoteliomas, angiomas em tufos, glomangiomas, GP e também os tumores vasculares malignos, como os hemangioendoteliossarcomas e os angiossarcomas. Já as MVs apresentam endotélio quiescente e são considerados defeitos na morfogênese vascular, provavelmente devido a uma disfunção nas vias de regulação da embriogênese e vasculogênese, compreendendo todas as malformações congênitas do sistema vascular, tais como as malformações arteriais, venosas, linfáticas, capilares e suas combinações. (ENJORAS; WASSEF; CHAPOT, 2009).
Com a aplicação da classificação da ISSVA tornou-se possível um melhor diálogo entre os profissionais e uniformização na nomenclatura entre clínicos, cirurgiões e patologistas (ENJORAS; WASSEF; CHAPOT, 2009; GOLDENBERG, 2002). A diferenciação entre estes dois grupos é essencial, não apenas devido as suas características clínicas, radiográficas e patológicas e sua morbidade, mas também devido seus tratamentos serem bastante diferentes (HIRAKI; GOLDENBERG, 2010). Entretanto, o termo “hemangioma” historicamente continua sendo usado indiscriminadamente para se referir a qualquer anomalia vascular (HASSANEIN et al., 2011).
Burrows et al. (1998) observaram que o tratamento adequado das anomalias vasculares se inicia com o correto diagnóstico e que significativo número de pacientes portadores de lesões vasculares recebe tratamento ineficaz e potencialmente lesivo em função de diagnósticos errôneos. Hassanein et al. (2011) realizaram um estudo com objetivo de determinar se a classificação proposta pela ISSVA (1996) está sendo usado
para categorizar corretamente as anomalias vasculares e se nomenclatura incorreta afeta o atendimento ao paciente. Em seus resultados eles encontraram que o "Hemangioma" foi usado incorretamente em 71,3% das publicações feitas no PubMed no ano de 2009. Além disso, pacientes cujas lesões foram rotuladas de forma errada eram mais propensos a receber tratamento inadequado (20,6%) em comparação com indivíduos cujas lesões foram designadas usando o sistema da ISSVA.
Utilizamos neste trabalho, a classificação biológica atualmente aceita pela ISSVA, assim sendo, foram analisados uma série de casos de GP e HEM e MVs, consideradas lesões de comportamento biológico benigno. No entanto, apesar deste comportamento biológico, se faz importante o estabelecimento do correto diagnóstico das lesões vasculares, haja vista que estas entidades exibem características clínicas e histológicas semelhantes em alguns casos.
No que concerne aos achados morfológicos verificados nas lesões analisadas neste estudo, observou grande similaridade entre os casos, concordantes com as citações de Vasconcelos et al. (2011), Buckmiller, Suen (2010), Seo et al. (2009), Johann et al. (2007), Freitas et al. (2005), Leon-Villapalos et al. (2005), North et al., (2000), onde enfatizam que o diagnóstico diferencial histológico entre HEM e MV ou GP pode ser difícil, pois, por exemplo, o HEM na fase de involução pode apresentar semelhanças histológicas com a MV, e o HEM com inflamação pode apresentar semelhanças histológicas com o GP em si. Nesse contexto, além da informação clínica bem descrita e anamnese detalhada, a utilização de biomarcadores com finalidade de contribuir no diagnóstico diferencial, assim como, a reclassificação dessas lesões tem sido bastante aconselhada.
Com relação aos biomarcadores, identificaram-se nos HEMs a presença de imunoexpressão para a proteína GLUT-1, que é também expressa na placenta, tecidos embrionários e fetais. Entretanto, esta proteína não apresenta relação com atividade mitótica e não é expressa em outras patologias vasculares, como GP e MV. É considerado um marcador específico para diagnóstico do HEM infantil e encontra-se presente em todas as suas fases evolutivas (ENJORAS; WASSEF; CHAPOT, 2009; BOYE; JINNIN; OLSEN, 2009). Assim, a expressão de GLUT-1 representa uma característica intrínseca do fenótipo endotelial dessas lesões e permite a distinção imuno-histoquímica de outros tumores vasculares benignos e outras anomalias histologicamente semelhantes (NORTH et al., 2001).
De acordo com North et al. (2000), a proteína GLUT-1 poderia auxiliar o crescimento celular por transportar glicose, vitamina C, galactose, água, glicopeptídeos e outras moléculas para as células, podendo auxiliar desta forma na proliferação do HEM. Além disso, na vida pós-natal, as células que deveriam ser negativas a GLUT-1 continuam a expressar esta proteína, estando este fato associado a um aumento da atividade proliferativa e da necessidade energética, podendo exercer um papel importante na fase proliferativa de HEM (YOUNES et al. 1997). Entretanto, a persistência desse transportador na fase involuída do HEM sugere que essa expressão não é uma adaptação temporária do aumento da demanda de glicose devido à alta taxa de mitose, e sim caracteriza a especificidade dessa proteína como marcador específico dessa lesão (NORTH et al., 2000).
Younes et al. (1997) propuseram que a ausência de detecção da GLUT-1 na maioria dos tecidos humanos normais e nas neoplasias epiteliais benignas sugere duas hipóteses: 1) essa proteína está sendo degradada rapidamente no tecido humano normal e/ou 2) o anticorpo ou o método de detecção não é sensível o suficiente para identificar a GLUT-1 na maioria dos tecidos normais, cuja expressão pode ser pequena.
Dentro dessa perspectiva, o presente trabalho investigou a presença da proteína GLUT-1 em 30 casos com diagnóstico histológico prévio de HEM e 30 casos de GP orais. Essas lesões foram submetidas à análise imuno-histoquímica e posteriormente foram reclassificadas de acordo com os resultados obtidos.
Considerando que GLUT-1 é específico pra o HEM e de posse dos nossos resultados imuno-histoquímicos e histológicos, foi necessária, uma reclassificação das lesões inicialmente diagnosticadas como HEM oral que não foram imuno-positivas para o marcador em questão. 10 dos 30 casos com diagnóstico inicial de HEM correspondiam ao GP e 13 à MV. De acordo com os dados analisados, nossos resultados sugerem que a análise histológica nem sempre é suficiente para a correta conclusão do diagnóstico de HEM oral.
Al-Adnani et al. (2006) realizaram um estudo, onde foi aplicado a classificação da ISSVA a todos os espécimes de anomalia vascular cutânea recebidos durante um período de 2 anos, com o intuito de avaliar o valor dessa classificação para uso de diagnóstico por patologistas. Semelhante ao nosso estudo, esses autores utilizaram um protocolo padrão de imuno-histoquímica para GLUT-1 para confirmar os casos com suspeitas de hemangioma. Em seus resultados, eles observaram que HEM representou 46% dos casos. No entanto, na coloração de hematoxilina e eosina, 18% dos casos
inicialmente pareciam representar MV, sendo seu diagnóstico de HEM confirmado pela imunoexpressão da GLUT-1. Os casos de MV representaram 30%, entretanto nenhum desses casos tinham sido subclassificados de acordo com seus vasos predominantes. Assim, a classificação proposta pela ISSVA pode ser rotineiramente aplicada a amostras de diagnóstico histopatológico. No entanto, concordando com a presente pesquisa, a coloração imuno-histoquímica de rotina para GLUT-1 se faz necessária em algumas situações de casos para a sua classificação correta.
Ainda nesse contexto, Bruder et al. (2009) em sua pesquisa realizaram uma reavaliação clínico-patológica e aplicação da classificação ISSVA em lesões vasculares ósseas em crianças, adolescentes e adultos jovens. Foi observado que certas lesões ósseas muitas vezes consideradas como tumores devem ser classificados como MV. Por fim, esses autores comentam que a padronização da nomenclatura é fundamental para a comunicação científica e a gestão do paciente, recomendando que a classificação da ISSVA deva ser aplicada a lesões tanto ósseas, como de tecido mole e vísceras. Concordamos com os autores com relação á classificação da ISSVA para os tumores vasculares ser fundamental para a comunicação científica e manejo do paciente. Em nossa pesquisa apesar de termos utilizado lesões vasculares de tecido mole oral, verificamos em uma pequena amostragem que lesões que previamente foram classificadas como tumores vasculares, na realidade se tratavam de mal formações vasculares.
Johann et al. (2007) realizaram um estudo quanto a imunoexpressão da GLUT-1 em lesões vasculares. Analisaram imuno-histoquimicamente 93 casos diagnosticados histologicamente como lesões vasculares benignas de boca: 19 HEM, 48 GP, 17 MV e 9 varizes (VAR). Nenhum dos casos de lesões vasculares benignas de boca foi imuno- positivo para GLUT-1. Os 19 casos diagnosticados inicialmente como HEM de boca mostraram negatividade para GLUT-1 sendo reclassificados como GP ou MV oral. Dados semelhantes aos obtidos pelos autores forma observados no presente trabalho.
Essa reclassificação é fundamental principalmente na hora de definir o tratamento, prognóstico e na avaliação de respostas a novas terapias, principalmente quando se considera que o HEM geralmente apresenta involução espontânea e que a MV e o GP não apresentam (HASSANEIN et al., 2011; JOHANN et al., 2007; AL- ADNANI et al., 2006).
No que se refere à expressão da GLUT-1 nos casos com diagnóstico inicial de HEM, nossos resultados apontam que a presença da marcação foi identificada apenas em 23% dos casos, sendo os remanescentes imuno-negativos para a GLUT-1. Esses resultados discordam dos achados de North et al. (2001 a e 2001b), Li et al. (2003), Mo et al. (2004), Lyons et al. (2004), Nguyen et al. (2004), Drut e Drut (2004), os quais observaram imuno-positividade para GLUT-1 nas células endoteliais de 100% dos casos de HEM.
North et al. (2001b) investigaram 43 lesões vasculares com base na análise histológica e imuno-histoquímica para GLUT-1. No entanto, esses autores estudaram lesões vasculares de cabeça, pescoço, tronco, extremidades superiores e inferiores, diferentemente do nosso estudo, o qual todos os casos estudados se localizavam na cavidade oral. Nos resultados, os autores observaram que 100% dos casos HEM foram positivos, diferentemente do nosso, pois apenas 23% dos casos foram positivos. A diferença desses achados pode ser justificada por diferenças técnicas relacionadas aos anticorpos utilizados, sistemas de visualização empregados na técnica imuno- histoquímica e métodos de recuperação antigênica.
Lyons et al. (2004) observaram intensa imuno-reatividade para GLUT-1, em células endoteliais, em 100% casos de HEM não identificando a localização. NGUYEN et al. (2004) verificaram intensa imuno-positividade para GLUT-1, em células endoteliais, em 100% de casos de HEM localizados no tronco,na genitália e na cabeça, incluindo a boca: 2 casos no lábio e 2 na mucosa jugal. Drut e Drut (2004) observaram intensa imuno-reatividade para GLUT-1 em células endoteliais em 100% de casos de HEM de placenta, pele, fígado, glândulas mamárias e submandibulares. No presente estudo, 77% dos casos com diagnóstico inicial de HEM foi imuno-negativo para GLUT- 1, o que na realidade conduziu ao diagnóstico de GP e MVs. As diferenças na expressão do GLUT-1, além das questões técnicas já abordadas, podem ser explicadas pelas diferentes localizações das lesões bem como por métodos de análise diferentes.
Apenas dois tipos de HEM são negativos para GLUT-1: HEM congêntino rapidamente involutivo (HEMCRI) e HEM congênito não involutivo (HEMCNI). O HEMCRI apresenta-se completamente formado após o nascimento e rápida involução no início da infância. Histologicamente caracteriza-se pela proliferação de células endoteliais organizadas em lóbulos de diferentes tamanhos com áreas involuídas sem lóbulos. Os vasos sangüíneos são formados por células endoteliais arredondadas e membrana basal fina na fase inicial e espessada na fase de regressão rápida. O
HEMCNI apresenta-se completamente formado ao nascimento e não cresce na vida pós- natal. Essa lesão é composta por pequenos vasos organizados em pequenos a grandes lóbulos separados por feixes de tecido conjuntivo denso fibroso e microfístulas arterio- venosas. As células endoteliais apresentam-se arredondadas e os vasos revelam finas membranas basais (BERENGER et al., 2003; ENJOLRAS et al., 2001; MULLIKEN e ENJOLRAS, 2004; NORT et al., 2001b). Nenhum dos casos avaliados no nosso estudo era congênito, não correspondendo a nenhuma das lesões supracitadas.
North et al. (2000) observaram que quatro lesões classificadas histologicamente como HEM foram imuno-negativas para GLUT-1. Entretanto, duas dessas lesões apresentavam características que pudessem explicar a falta de marcação: eram congênitas, não apresentavam crescimento pós-natal e histologicamente se evidenciavam uma proliferação de capilares organizada em lóbulos celulares bem desenvolvidos demarcados por espessos septos conjuntivos. Assim, considerando estes aspectos os autores sugeriram que se tratavam, possivelmente, de granuloma piogênico. As outras duas lesões também eram congênitas e foram removidas de crianças mais velhas sendo classificadas como HEM involuído. Concordamos com Johann et al. (2007), os quais comentam que torna-se extremamente difícil diferenciar HEM involuído de MV, assim, provavelmente nos casos de HEM negativos observados no trabalho de North et al. (2000) na verdade se tratavam de MV já que essas são imuno- negativas a GLUT-1 semelhante ao detectado no presente estudo.
Dyduch et al. (2004) encontraram casos de HEM (35%) negativos para GLUT-1. Esses autores classificaram uma dessas lesões como HEMCNI e afirmaram que, apesar de GLUT-1 ser altamente específica para HEM, a ausência de marcação em lesões vasculares não exclui o diagnóstico de uma variante do HEM verdadeiro.
Leon-Villapalos et al. (2005) observaram ausência de marcação para GLUT-1 nas células endoteliais em 5% dos 19 casos de HEM. Os autores acreditam que esse único caso de HEM negativo para GLUT-1 possa ter perdido a expressão de GLUT-1 com a involução. Entretanto esta hipótese contradiz os achados de North et al. (2000 e 2001a) e Mo et al. (2004) que encontraram marcação positiva em todas as fases de desenvolvimento do HEM.
Imuno-negatividade microvascular para GLUT-1 foi identificada em 100% de casos de GP observados nos estudos de North et al. (2000, 2001a e 2001b), Dyduch et al. (2004) e Leon-Villapalos et al. (2005). Apesar desses casos não serem localizados em boca, os resultados foram semelhante aos nossos, onde também revelamos ausência
de marcação para GLUT-1 em GP oral. Assim, foi demonstrada a eficácia da análise histológica para essas lesões. No nosso estudo 10 casos inicialmente diagnosticados como HEM de boca eram, na realidade, GP. Isso demonstra que o HEM pode apresentar similaridades histológicas com GP, principalmente na fase proliferativa onde o HEM pode apresentar uma organização lobular assemelhando-se ao GP (FRIEDEN; ESTERLY, 1992; NORTH et al., 2000, 2001a; FISHMAN e MULLIKEN, 1993).
Se tratando de lesões vasculares, a angiogênese é um evento crucial no seu desenvolvimento e progressão, sendo um dos mais importantes estímulos para a neovascularização o processo de hipóxia. A condição de hipóxia tecidual induz a liberação de fatores de crescimento e desequilibra o processo normal de ajuste entre os fatores pró e antiangiogênicos, formando novos capilares no tumor, a partir de células endoteliais pré-existentes (FOLKMAN, 1971; FOX; GASPARINI; HARRIS, 2001).
A respeito desse contexto, o crescimento tumoral exige oxigênio, nutrientes e função metabólica adequada para se desenvolver, tornando-se necessário promover a angiogênese para inibir a apoptose das células tumorais desencadeada pela hipóxia (HORSMAN, 1998).
Muitos estudos têm demonstrado a participação do HIF-1, regulador central das respostas às mudanças na concentração de O2, em processos patológicos, através do
controle transcricional de um grande número de genes envolvidos na angiogênese, transportadores de glicose (GLUT-1), reguladores de pH (CA-IX), enzimas glicolíticas e fatores de sobrevivência celular (PUGH; RATCLIFFE, 2003; SEMENZA, 2006; SMITH; ROBBINS; RATCLIFFE et al., 2008).
A expressão e ativação do HIF-1α, entretanto, não são apenas estimuladas pela hipóxia (HUANG E BUNN, 2003; RICHARD et al, 2000; WENGER, 2002). Citocinas pró-inflamatórias, incluindo TNF-α e interleucina-1 (ALBINA et al. 2001; HADDAD; LAND, 2001; SANDAU et al., 2001) e uma variedade de produtores microbianos, tais como lipopolissacarídeos (BLOUIN et al., 2004), lipoproteínas e ácidos nucléicos podem induzir a expressão HIF-1α. Em contraste com o estímulo de hipóxia, que depende muito da estabilização da proteína HIF-1α, estímulos não hipóxicos para a indução da expressão do HIF-1α envolve o caminho da fosfatidilinositol 3-quinase / Akt, a proteína quinase ativada por mitógeno e caminhos diglicerídeos (FUKUDA et al, 2002;. LIU et al, 2002; TREINS et al, 2002).
Portanto, considerando a necessidade atual do descobrimento de novos parâmetros patológicos e/ou ferramentas diagnósticas que possam agilizar o diagnóstico
diferencial entre determinadas lesões vasculares, na presente pesquisa também se avaliou a expressão imuno-histoquímica do HIF-1α, para análise da atividade angiogênica das células endoteliais, uma vez que existem poucos estudos que estudam a expressão dessa proteína em lesões vasculares. Assim, através dessa análise, buscou-se investigar se a condição de hipóxia e a expressão deste marcador poderiam fornecer informações adicionais para o entendimento dos mecanismos biológicos destas lesões, visto que as mesmas apresentam, na maioria das vezes, grande analogia clínica e histopatológica.
No que concerne a análise da expressão da proteína HIF-1α, evidenciou-se estatisticamente na presente pesquisa maior frequência de marcação nas células endoteliais nos casos de GP, quando comparado às outras lesões, em especial a MV, fato este comprovado pelas medianas (Tabela 5) que revelaram diferença estatisticamente significativa (p < 0,05) entre essas duas lesões.
De acordo com Ameri et al. (2010), as células tumorais circulantes em uma lesão mostraram uma resposta a hipóxia alterada e um fenótipo agressivo mais forte. Isso pode sugerir que nas lesões tumorais, as células estariam mais em condições de hipóxia, estando concordante com nossos resultados onde foi observado diferença estatisticamente significativa entre lesão tumoral (GP) e lesão não tumoral (MV).
Há muitas maneiras em que a ativação do HIF-1α poderia levar a mudanças no comportamento de células tumorais (CHANG et al., 2006). Os mecanismos já reconhecidos nesse processo de mudanças causados pelo HIF-1α estão relacionados à sua capacidade de promover a angiogênese e um aumento do fluxo glicolítico (DANG et al., 1997). Entretanto, a contribuição da ativação do HIF nos aspectos da biologia do tumor, como o crescimento e evolução para um fenótipo mais agressivo é muito menos compreendida do que o seu papel na promoção da angiogênese e glicólise (CHANG et al., 2006). De acordo com Tang et al. (2004), a exclusão condicional de HIF-1α em células endoteliais prejudicaria a angiogênese tumoral e está associado com uma diminuição na densidade de vasos do tumor.
Além disso, somando-se aos aspectos descritos anteriormente, a maior expressão do HIF-1α no GP, pode ser associada ao fato de que nessas lesões se encontrou uma forte presença de um infiltrado inflamatório, corroborando o estudo de Albina et al.