Learning from physical objects

O estudo consistiu de uma avaliação observacional, descritiva e retrospectiva da expressão imunoistoquímica do EGFR e da PDPN em CRs e CDs.

4.2.1 Variáveis

As variáveis analisadas neste estudo foram classificadas segundo informações que constam nos Quadros 1 e 2.

Quadro 1 – Classificação das variáveis dependentes. Natal-RN, 2014. VARIÁVEIS DEPENDENTES

TIPO CLASSIFICAÇÃO

Imunoexpressão para EGFR Qualitativa ordinal Imunoexpressão para

podoplanina Qualitativa ordinal

Quadro 2 – Classificação das variáveis independentes. Natal-RN, 2014. VARIÁVEIS INDEPENDENTES

TIPO CLASSIFICAÇÃO

Tipo de cisto Qualitativa nominal mutualmente _exclusiva Grau de inflamação Qualitativa ordinal

Localização celular da

imunocoloração Qualitativa nominal exaustiva Camadas epiteliais

4.3 POPULAÇÃO

Todos os casos de CRs e CDs diagnosticados e arquivados no Setor de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), entre os anos de 1985 e 2013.

4.4 AMOSTRA

A amostra foi intencional e composta por 60 espécimes de CRs e CDs incluídos em parafina, obtidos a partir dos registros do Serviço de Patologia Oral da UFRN. Estes foram selecionados com a finalidade de se obter 30 casos de CRs e 30 casos de CDs segundo os critérios de seleção da amostra.

4.4.1 Critérios de seleção da amostra

4.4.1.1 Critérios de Inclusão da Amostra

 Foram incluídos casos diagnosticados como CRs e CDs, que exibiram aspectos histopatológicos bem definidos pré-estabelecidos e confirmados por dados radiográficos. Foram selecionados apenas os casos que exibiram uma cavidade patológica revestida total ou parcialmente por epitélio pavimentoso estratificado não ceratinizado que apresentaram subjacente ao mesmo uma quantidade suficiente de cápsula fibrosa para realização da análise morfológica.

 Para os CRs, não houve restrição com relação ao local de acometimento.

 Para os CDs, foram incluídos apenas os espécimes provenientes de lesões em região de terceiro molar (maxilar ou mandibular) e região anterior da maxila, associadas a dentes totalmente inclusos.

 Foram selecionados apenas os casos que possuíram material biológico suficiente nos blocos de parafina para o desenvolvimento da pesquisa.

 Foram excluídos do estudo os casos que não satisfizeram os critérios de inclusão anteriormente citados.

4.5 ESTUDO MORFOLÓGICO

O estudo morfológico foi realizado em lâminas coradas pela técnica de rotina da hematoxilina e eosina, já existentes no arquivo do laboratório de Anatomia Patológica da disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da UFRN. Por meio da microscopia de luz, investigou-se a intensidade do infiltrado inflamatório presente no tecido conjuntivo/cápsula, que foi classificada de acordo com critérios adaptados do estudo de Tsai et.al. (2004).

No aumento de 100x, a partir da porção luminal das lesões císticas em direção à periferia, ou seja, a partir da região subepitelial, a cápsula fibrosa foi dividida em terços, formando três campos microscópicos consecutivos. Os espécimes cujo infiltrado inflamatório era ausente ou se apresentou restrito ao primeiro campo microscópico, foram classificados como grau 1 (ausente ou leve infiltrado inflamatório); as lesões com células inflamatórias presentes até o segundo campo microscópico foram definidas como grau 2 (moderado infiltrado inflamatório); e as lesões que exibiram infiltrado inflamatório até o terceiro campo microscópico, foram categorizadas como de grau 3, conforme ilustra a figura 1. As avaliações foram realizadas por um único examinador previamente treinado e os dados transcritos para uma ficha elaborada para o estudo (Apêndice A).

Figura 1: Ilustração da análise do infiltrado inflamatório em CRs, segundo

metodologia adaptada do estudo do estudo de Tsai et al. (2004).

Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral da UFRN. Fotomicrografia obtida em microscópio de luz no aumento de 100x.

4.6 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO

Os espécimes fixados em formol a 10%, incluídos em parafina e selecionados para a pesquisa, foram submetidos a cortes histológicos de 3 µm de espessura e estendidos em lâminas de vidro, previamente limpas, desengorduradas e preparadas com adesivo à base de organosilano (3-aminopropyltrietoxy-silano, Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA). Posteriormente, o material foi submetido ao método da imunoperoxidase pela técnica baseada em polímeros de dextrano (ADVANCETM _{HRP, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA), utilizando} anticorpos monoclonais anti-EGFR e anti-PDPN, conforme mostra o quadro 3.

Quadro 3 - Especificações dos anticorpos primários utilizados na pesquisa. Natal-RN, 2014.

*Spring Bioscience, Inc., Pleasanton, CA, USA; **Dako North America, Inc., Carpinteria, CA, USA. Como controle positivo foi utilizado espécime de carcinoma epidermóide oral. O controle negativo consistiu na substituição do anticorpo primário por albumina de soro bovino (BSA) a 1% em solução tampão.

A técnica utilizada seguiu o protocolo descrito abaixo:

 Desparafinização: 2 banhos em xilol, ambos por 10 minutos em temperatura ambiente;

 Reidratação em cadeia descendente de etanóis:  Álcool etílico absoluto I (3 minutos);  Álcool etílico absoluto II (3 minutos);  Álcool etílico absoluto III (3 minutos);  Álcool etílico 95°GL (3 minutos);  Álcool etílico 80°GL (3 minutos);

Especificidade/ Clone

No do

Catálogo Fabricante Diluição Sistema Recuperação _Antigênica Incubação

EGFR (SP9)

SPB

M3090 _Bioscience* Spring 1:200 Advance

Citrato ph 6,0 Pascal minutos 60 Podoplanina (D2-40) M3619 Dako** 1:400 Advance Tris/EDTA ph 9,0 Pascal Overnight

 Remoção de pigmentos formólicos com hidróxido de amônia a 10% em etanol 95° em temperatura ambiente (10 minutos);

 Lavagem em água corrente (5 minutos);

 Duas passagens em água destilada (3 minutos cada);  Recuperação antigênica (Quadro 3);

 Lavagem em água corrente (10 minutos);

 Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);

 Uma incubação dos cortes em solução de peróxido de hidrogênio 3% 10 volumes para o bloqueio da peroxidase endógena tecidual (15 minutos cada);

 Lavagem em água corrente (10 minutos);

 Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);

 Uma passagem em solução tampão TRIS-HCl (tris-hidroximetil-aminometano, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA) pH 7,4;

 Incubação dos cortes com anticorpos primários (Quadro 3) em solução diluente (Antibody diluent with background reducing components, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA);

 Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4;

 Incubação com anticorpo secundário (ADVANCETM _{HRP Link, Dako North} America Inc., Carpinteria, CA, USA), à temperatura ambiente (30 minutos);

 Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos cada);

 Incubação com anticorpo polimerizado à peroxidase (ADVANCETM _{HRP Enzyme,} Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA e Kit LSAB HRP, Dako Cytomation, Carpinteria, CA, USA), à temperatura ambiente (30 minutos);

 Duas passagens em solução tampão TRIS-HCL pH 7,4 (5 minutos cada);

 Revelação da reação com solução cromógena de 3,3-diaminobenzidina (Liquid DAB+ Substrate, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA) (10 minutos);  Lavagem em água corrente (10 minutos);

 Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);

 Contracoloração com hematoxilina de Mayer, à temperatura ambiente (10 minutos);

 Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:  Álcool etílico 80°GL (2 minutos);

 Álcool etílico 95°GL (2 minutos);  Álcool etílico absoluto I (5 minutos);  Álcool etílico absoluto II (5 minutos);  Álcool etílico absoluto III (5 minutos);  Duas passagens em xilol (2 minutos cada);

 Montagem em resina Permount® (Fisher Scientific Inc., Fair Lawn, NJ, USA), para análise em microscópio de luz.

4.7 ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA

As lâminas coradas pela técnica de imunoistoquímica foram analisadas em microscópio de luz, em um aumento de 400x e as características do padrão de expressão celular de cada imunomarcador anotadas em fichas especiais previamente elaboradas para o estudo (Apêndice B).

A análise das células imunomarcadas para EGFR e PDPN foi realizada somente no revestimento epitelial, de forma semiquantitativa, segundo metodologia adaptada do estudo de Gonçalves et al. (2012). Foram consideradas imunopositivas as células do revestimento epitelial cístico que apresentaram coloração acastanhada, independente da intensidade. Os casos foram classificados de acordo com a porcentagem de células positivas em: Escore I - 0 a 5% de células positivas; Escore II - 5 a 50% de células positivas; Escore III - acima de 50% das células positivas.

Seguindo a metodologia adaptada do estudo de Oliveira et al. (2011), foi analisada também a localização da imunomarcação nas células individualmente (membranar, citoplasmática, ou em ambas) e nas diferentes camadas do epitélio (basal, suprabasal e superficial).