Developing “New products” through reinterpretation

O CD, também chamado de cisto folicular, é um cisto odontogênico de desenvolvimento, originado através do acúmulo de fluido entre o remanescente do OE e a coroa dentária subjacente de um dente não irrompido, causando expansão de seu folículo, permanecendo preso à região cervical (junção cemento-esmalte) (GIL e DOMINGUES, 2007; SHEAR e SPEIGHT, 2011; DANTAS et al., 2012). É o segundo tipo mais comum dos cistos odontogênicos e o mais comum entre os cistos de desenvolvimento dos maxilares (SELVAMANI et al, 2012).

São geralmente presentes na segunda ou terceira décadas de vida (RAVI et al., 2012), e em indivíduos do sexo masculino (AVELAR et al., 2009).Ocorrem, com maior frequência, em associação com terceiros molares inferiores e caninos superiores, pois estes são os dentes que se apresentam mais comumente impactados (XU et al., 2011; LIMA et al., 2013). Trata-se de uma lesão cística comum, solitária e assintomática (COSTA et al., 2011), porém, múltiplos cistos podem ocorrer em associação com síndromes como a Síndrome de Gardner, Síndrome de Maroteaux-Lamy, Mucopolissacaridose, Síndrome do nevo basocelular (RAVI et al., 2012). Geralmente, apresentam pequenas dimensões, mas, em alguns casos, atingem tamanhos consideráveis causando expansão óssea e assimetria facial. A estimativa de tamanho desta lesão é muito variável, podendo ser confundida com um folículo pericoronário (FP) (CARVALHO et al., 2011).

A presença deste cisto impede a erupção do dente a ele vinculado, porém raramente aparecem na dentição decídua. São rotineiramente diagnosticados através de radiografias panorâmicas ou periapicais de rotina e radiograficamente constitui-se de uma área radiolúcida associada a um dente não irrompido ou retido, circundado por uma linha esclerótica (MARZOLA; PEREIRA; TOLEDO FILHO, 2007; DANTAS et al., 2012). O tratamento da lesão é realizado através de intervenção

cirúrgica com remoção completa da lesão, precedida por punção aspirativa e biópsia incisional. O índice de recidiva é baixo e possui um prognóstico favorável (VAZ; RODRIGUES; JUNIOR, 2010).

A histogênese exata não é conhecida, porém o fator chave parece ser o acúmulo de fluido entre o EROE e o esmalte ou no OE, entre suas camadas. Esse acúmulo ocorre como resultado da pressão exercida no folículo, pela tentativa de erupção de um dente incluso, que obstrui o fluxo venoso e, assim, induz a rápida transudação de soro através das paredes capilares. Por outro lado, acredita-se que a origem provável deste cisto possa ser a destruição de células em proliferação do FP, após a interrupção da erupção. Esta destruição celular resulta no aumento da tensão osmótica e, portanto, na formação do cisto (BENN; ALTINI, 1996; TAMGADGE et al., 2011).

Afirma-se ainda que se desenvolva a partir da proliferação de remanescentes do OE ou do EROE após a formação completa ou parcial da coroa dental, em uma fase em que o retículo estrelado (RE) deveria ser reabsorvido biologicamente e, não o sendo, permanece como elemento responsável pelo desencadeamento cístico, e seu crescimento está relacionado tanto com a proliferação epitelial, como por fatores de reabsorção do osso e aumento da osmolaridade do fluido cístico (MARZOLA, 2005; XU et al., 2011; DANTAS et al., 2012; LIMA et al, 2013).

O EROE é formado por uma camada interna e uma externa. A interna consiste na camada onde os ameloblastos transformam-se e ficam firmemente aderidos à superfície do esmalte. A camada externa consiste de células mais achatadas, a remanescente de todas as camadas do órgão do esmalte. No desenvolvimento do CD, há acúmulo de líquido entre o EROE e o esmalte do dente, ou entre as camadas do EROE, líquido este proveniente do espaço intersticial. À medida que o cisto cresce, células epiteliais são descamadas para o interior do lúmem aumentando assim o conteúdo proteico do líquido cístico, atraindo mais líquido do conjuntivo para a cavidade cística (GIL; DOMINGUES, 2007).

Dependendo do estado de involução do RE, o CD apresenta os subtipos: Central, aderido à coroa dental; Lateral, aderido à face mesial, distal, lingual ou vestibular; Extrafolicular, no qual o retículo se solta da coroa dental, individualizando- se, sendo central quando superficializa a coroa; lateral, já que se desprende para os lados (MARZOLA, 2005).

Quando esta lesão é removida cirurgicamente e enviada para análise histopatológica evidencia-se aspectos diferentes caso o cisto esteja inflamado ou não (NEVILLE et al., 2009). No CD não inflamado é observada parede cística fibrosa delgada que, sendo derivada do FP, consiste em fibroblastos jovens amplamente

separados pelo estroma e uma substância fundamental rica em

mucopolissacarídeos ácidos (SHEAR; SPEIGHT, 2011). A cápsula de tecido conjuntivo fibroso é arranjada frouxamente e a substância fundamental contém quantidade considerável de glicosaminoglicanas. Pequenas ilhas ou cordões de restos de epitélio odontogênico aparentemente inativo podem estar presentes na cápsula. O revestimento epitelial, que na verdade é o EROE, consiste de duas a quatro camadas de células achatadas não ceratinizadas, e a interface entre epitélio e tecido conjuntivo é plana (SHEAR; SPEIGHT, 2011; RAVI et al., 2012).

Em um CD inflamado, a cápsula fibrosa é mais colagenizada e o infiltrado crônico de células inflamatórias é variável. O limitante epitelial mostra quantidade variável de hiperplasia com desenvolvimento de projeções epiteliais e aspecto escamoso mais definido (NEVILLE et al., 2009). Células mucosas ocasionalmente são evidenciadas no limitante epitelial e raramente são encontrados na cápsula células colunares ciliadas e pequenos conglomerados de células sebáceas (NEVILLE et al., 2009; SHEAR; SPEIGHT, 2011).

Godoy, em 2001, desenvolveu um estudo que teve como objetivo realizar uma análise clinicopatológica de 108 casos de CDs previamente diagnosticados. Pretendeu-se correlacionar os achados histomorfológicos e os dados epidemiológicos, que constavam nas fichas de solicitação de exame histopatológico, no intuito de caracterizar uma possível variante da lesão, denominada CD de origem inflamatória. A análise histomorfológica revelou que as lesões exibiram, em sua maioria, um limitante epitelial delgado, com uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso ricamente vascularizado, colageinizado e com uma relativa predominância de um intenso infiltrado inflamatório mononuclear. A correlação clinicopatológica mostrou que 11 dos 12 casos de cistos que apresentaram um limitante epitelial espesso, com alto grau de vascularização e colageinização, e intenso infiltrado inflamatório na cápsula cística estiveram localizados na região de pré-molares, em pacientes abaixo de 12 anos de idade e que, em sua maioria, apresentaram sintomatologia dolorosa, características compatíveis com o CD inflamatório. Concluiu-se, frente a esses

resultados, que esta lesão, é passível de ser considerada uma variante do CD, levando a sugerir a denominação de “cisto folicular inflamatório” para esta entidade. 2.3 EGFR

O EGFR é uma glicoproteína transmembranar que constitui um dos quatro membros da família erbB de receptores da tirosina cinase. A ligação do EGFR aos seus ligantes leva à auto fosforilação do receptor de tirosina cinase e ativação subsequente de vias de transdução de sinal que estão envolvidos na regulação da proliferação e diferenciação celular epitelial. A família do EGFR inclui quatro receptores: o receptor do fator de crescimento epidérmico 1 (EGFR, c-erbB-1, HER- 1), c-erbB-2 (HER-2), c-erbB-3 (HER- 3) e c-erbB-4 (HER-4). EGFR foi o primeiro membro deste grupo a ser descrito. É uma glicoproteína com 170-kd, e consiste de um receptor com um domínio extracelular, uma região transmembranar, e um domínio intracelular com função de tirosina cinase (HERBST, 2004; PAYERAS et al., 2007; BERNARDES et al., 2010; MICHIKAWA et al., 2011).

Vários ligantes podem ativar o EGFR, incluindo o EGF, TGF-α, anfiregulina, EGF de ligação à heparina e betacelulina, sendo o EGF e o TGF-α considerados os mais importantes. Esta ligação ocasiona a homo ou heterodimerização do receptor na superfície da célula, seguida pela internalização do receptor dimerizado. Após estas etapas, ocorre a autofosforilação dos domínios de tirosina cinase na região intracitoplasmática. Resíduos de tirosina cinase fosforilados servem como locais de ligação para o recrutamento de transdutores e ativadores de sinalização intracelular tais como o Ras, que em seguida estimulam uma cascata de transdução de sinal intracelular. O Ras-Raf, ativado pela proteína cinase, e o fosfatidil-inositol 3 cinase e Akt, são as duas principais rotas de sinalização para a família HER, onde o EGFR também está incluído. Estas vias regulam múltiplos processos biológicos de proliferação celular, angiogênese e inibição da apoptose (JORISSEN et al., 2003; HERBST, 2004).

Todas as células epiteliais normais requerem estimulação com base em sinais para se submeterem ao crescimento, diferenciação e proliferação, muitos dos quais realizados por fatores de crescimento. O EGFR desempenha, portanto, um papel

importante na diferenciação e morfogênese de diversos órgãos e na proliferação e sobrevivência de células em mamíferos (SARKIS et al., 2010).

Embora esteja presente em células normais, o EGFR tem sua expressão elevada na maioria dos tumores sólidos incluindo o câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer oral, carcinoma de células não pequenas de pulmão, câncer renal, câncer de ovário e câncer de cólon. Nas células normais, sua expressão varia de 40.000 a 100.000 receptores por célula. Alguns cânceres de mama, por exemplo, podem expressar até 2 x 106 moléculas do EGFR por célula. Essa superexpressão produz intenso sinal de ativação de vias de sinalização, resultando em células que têm um crescimento mais agressivo, características de invasão, e associação com prognóstico pobre e menor sobrevida. Também desempenha um papel na resistência à quimioterapia e tratamento de radiação em células tumorais (HERBST, 2004; HIRAISHI et al., 2006; LEE et al., 2010).

Além de estudos que avaliaram a expressão do EGFR em tumores malignos, autores direcionaram suas pesquisas na avaliação da expressão deste receptor em lesões odontogênicas, visto que sua expressão tem sido observada no epitélio de mucosa oral normal, gengiva saudável e inflamada, lesões inflamatórias periapicais, tecidos envolvidos com o desenvolvimento dentário e em FP, analisando remanescentes do epitélio odontogênico (WANG et al., 1990; NORDLUND et al., 1991; COBO et al., 1992; LIN et al., 1996; BAUMGART, 2003).

Wang et al. (1990) estudaram a presença do EGFR, através de “western blot”, em 12 espécimes de mucosa oral normal obtidas de indivíduos saudáveis. Foi descrita uma proteína com uma banda principal de 160K e uma banda menor de 170K, características estas partilhadas com os receptores do EGF em outros tecidos. Este estudo foi o primeiro a demonstrar a presença do receptor do EGF em mucosa oral humana.

Nordlund et al. (1991) examinaram espécimes gengivais de indivíduos adultod periodontalmente saudáveis, com periodontite, pacientes diagnosticados com periodontite juvenil (atualmente denominada periodontite agressiva), e em REM, obtidos do ligamento periodontal de um terceiro molar mandibular e um pré-molar, que foram removidos por causa de cáries e motivos ortodônticos, respectivamente. Além disso, foram detectados restos celulares a partir de uma biópsia de gengiva saudável. Utilizaram um anticorpo monoclonal dirigido contra o receptor do EGF

através da técnica de imunoistoquímica. Os receptores foram expressos em níveis elevados na superfície de células da camada basal do epitélio gengival. No epitélio juncional normal, por outro lado, a imunomarcação foi fraca ou negativa, indicando que os receptores são mal expressos ou ausentes nestas células. Não foram detectadas diferenças entre espécimes gengivais não inflamados de indivíduos adultos saudáveis e de pacientes com periodontite juvenil. Em biópsias de tecido gengival inflamado de pacientes adultos com periodontite, foi observada uma marcação intensa na superfície celular de células epiteliais em proliferação. Células epiteliais dos restos de Malassez ligaram-se intensamente ao anticorpo. Os resultados sugerem que o EGF está envolvido no controle do crescimento e diferenciação do epitélio em tecidos periodontais.

A expressão do EGF e seu receptor (EGFR) no desenvolvimento de dentes foram estudados por imunoistoquímica em embriões de rato (E-16 e E-21). Imunocoloração muito fraca foi observada nas células germinativas odontogênicas durante o estágio de broto, capuz e sino, bem como em algumas células ectomesenquimais. Em dentes desenvolvidos, mas que não erupcionaram, uma imunoreatividade moderada para EGF e EGFR estava presente nos odontoblastos, ameloblastos, e células do epitélio interno do órgão do esmalte, contudo, foi mais forte na dentina (COBO et al., 1992).

Shrestha et al. (1992) analisaram a imunoexpressão do EGFR em células epiteliais de 67 casos de cistos odontogênicos e 35 casos de tumores odontogênicos, utilizando anticorpo monoclonal para este receptor. As lesões císticas incluíam ceratocistos odontogênicos (atualmente denominado de tumor odontogênico ceratocístico-20 casos), cisto primordial (8 casos), CRs (20 casos) e em CDs (19 casos). Os tumores eram constituídos por ameloblastomas (21 casos), ameloblastoma de células granulares (4 casos), cisto odontogênico calcificante (TOC-4 casos), tumor odontogênico adenomatóide (TOA-4 casos), tumor odontogênico escamoso (2 casos) e fibroma ameloblástico (2 casos). Destes, ceratocisto e cisto primordial apresentaram 75% dos casos com imunopositividade para esse receptor. O CR apresentou imunopositividade em 35% dos casos, e o CD em 47,4% dos casos. Em todos os casos positivos a imunomarcação era apenas membranar. Imunomarcação negativa do EGFR foi um achado característico nos tumores odontogênicos de origem epitelial. Sugeriram então, que os cistos

odontogênicos, ao contrário dos tumores odontogênicos, são capazes de proliferação mediada por esse receptor.

Li et al. (1993) analisaram a imunoexpressão do EGFR em ceratocistos odontogênicos (13 casos), CDs (11 casos), CRs (11 casos), ameloblastomas (6 casos) e em GPs (7 casos). Os resultados mostraram que o revestimento epitelial de ceratocistos odontogênicos e de CDs geralmente expressavam níveis mais elevados de imunomarcação para o EGFR do que no revestimento de CRs (derivados dos REM). A menor imunomarcação do EGFR em CRs coincidia com a presença de alterações degenerativas no interior do epitélio associadas com infiltrados de células inflamatórias no local. Esta associação de reduzida expressão do EGFR e inflamação também foi detectada no revestimento de ceratocistos odontogênicos (derivados dos remanescentes da lâmina dental). Em qualquer caso, a maior expressão do EGFR nos cistos de desenvolvimento contra cistos inflamatórios apoiam a idéia de que diferentes mecanismos de iniciação e controle de proliferação de células epiteliais estão envolvidos em suas formações. O nível de expressão desse receptor parece estar relacionado com a presença de inflamação no interior do tecido conjuntivo adjacente em vez da proliferação de células epiteliais.

No estudo de Lin et al. (1996) foram examinados, através da imunoexpressão do EGFR, 15 lesões inflamatórias periapicais (10 GPs e 5 CRs), obtidos a partir de cirurgias periapicais, e 6 lesões periapicais adicionais (4 GPs e 2 CRs) coletados de dentes extraídos. Os resultados indicaram que os GPs apresentaram uma fraca imunocoloração ou baixa ligação específica. Em contraste, os CRs exibiram uma forte imunocoloração em células epiteliais e elevada ligação específica.

A imunoexpressão do EGFR foi investigada no trabalho de Bastawisy e Nouaem (2000) no revestimento epitelial de 20 cistos odontogênicos (CRs, CDs, ceratocistos, cistos odontogênicos calcificantes) e 17 tumores odontogênicos (ameloblastomas), utilizando anticorpo monoclonal dirigido contra esse receptor. Os resultados revelaram que houve expressão mais elevada desse receptor em ceratocistos, seguidos por cisto odontogênico calcificante e em menor quantidade nos CRs. Alguns casos de tumores odontogênicos mostraram expressão do EGFR que parecia estar relacionada à ceratinização. A ausência de sua expressão, em alguns cistos e tumores, indica que o crescimento nestes é EGF independentes, ou seja, não necessitam deste fator de crescimento para crescerem.

Todos os receptores, incluindo os da família erbB, são sintetizados e encaminhados para a sua localização celular específica, mesmo na ausência do ligante. No entanto, diferentes localizações do EGFR podem ser observadas, de acordo com o tipo celular específico e o anticorpo utilizado (WILEY, 2003). A importância potencial dos efeitos do EGF e, por conseguinte, a distribuição e expressão do seu receptor, em processos de desenvolvimento normais e patológicos, têm estimulado muitos estudos sobre a localização imunoistoquímica do EGFR e sua expressão diferencial (LI et., 1993).

Baumgart et al. (2007) investigaram a distribuição imunoistoquímica do EGFR em FPs como um preditor de progressão para cistos e tumores odontogênicos. Foram analisados os padrões de coloração no EROE e em ninhos de epitélio odontogênico associado com folículos de molares impactados. O padrão de coloração de 20 espécimes de FPs foi comparado com o de 16 amostras de mucosa oral normal e amostras de carcinomas epidermóides orais (CEOs). Os resultados mostraram que colorações citoplasmáticas e membranares foram observadas na mucosa oral normal, principalmente nas camadas proliferativas (basal e suprabasal), diminuindo de intensidade em direção à superfície. Os padrões de coloração observados no EROE foram citoplasmáticos apenas e combinados, resultado que é semelhante aos resultados da mucosa oral normal. Marcação do EGFR apenas na membrana pode ser um indicador de potencial aumentado para ninhos epiteliais de se tornarem cistos ou tumores odontogênicos.

Vicente et al. (2010) compararam o padrão de imunoexpressão do EGFR, ciclina D1, Ki-67, p-53 e antígeno carcinoembrionário (CEA) no revestimento epitelial de 11 ceratocistos odontogênicos, 10 CDs, 10 CRs e 10 ameloblastomas. A expressão do EGFR foi positiva em 100% dos ameloblastomas, 73% dos ceratocistos, 40% dos CDs e em 30% dos CRs. Em 9 casos de ameloblastomas a imunomarcação do EGFR era difusa, enquanto em 1 caso, a reação era focal. Em ceratocistos, o EGFR foi localizado na camada de células basais, e foi focal em 8 e difusa em nenhum caso. Em todos os casos de CDs e CRs positivos, a imunocoloração foi focal. Em todos os casos positivos a localização celular do EGFR foi membranar. Algumas destas descobertas podem apoiar a teoria de que ceratocistos odontogênicos são de origem neoplásica, mas outros resultados apoiam

claramente que estas lesões são cistos de desenvolvimento com algumas propriedades neoplásicas por causa do elevado potencial de crescimento intrínseco.

Oliveira et al. (2011) realizaram um estudo para avaliar o perfil de imunomarcação do EGFR, Ki-67 e survivina em tumores odontogênicos ceratocísticos (TOC-13 casos), CDs (14 casos) e em FPs (9 casos). A imunomarcação foi analisada nas camadas basal e suprabasal de TOCs e CDs, e em FPs, nas ilhas de epitélio odontogênico e/ou no EROE. Ceratocistos apresentaram a maior taxa de proliferação entre os três grupos, principalmente na camada suprabasal. Imunomarcação para EGFR foi observada principalmente no citoplasma nas camadas basal e suprabasal de ceratocistos e na camada suprabasal de CDs. Imunomarcação tanto membranar e citoplasmática foi maior em PFs, sendo que nestes a coloração apenas membranar também foi obsevada. Em CDs, a camada basal parecia proliferar em resposta ao estímulo. Embora FPs mostrassem baixa atividade proliferativa, a expressão do EGFR indica que algumas células apresentam uma elevada capacidade de resposta a estímulos, que provavelmente poderia explicar a origem de lesões odontogênicas.

O objetivo do estudo de Gonçalves et al. (2012) foi avaliar a expressão imunistoquímica da proteína p63, EGFR e Notch-1 no revestimento epitelial de CRs (35 casos), CDs (22 casos) e em TOCs (17 casos). Quase todos os casos demonstraram expressão de p63, EGFR e Notch-1. Para os CRs, a reação inflamatória crônica na cápsula fibrosa não influenciou a expressão do EGFR no revestimento epitelial. Não houve diferença estatística significativa entre quantidade da expressão e a intensidade da expressão do EGFR entre as lesões. Em CRs e CDs, para o EGFR, foi observada correlação positiva entre a quantidade da expressão e intensidade de coloração. Os autores sugeriram que o epitélio das lesões císticas é capaz de proliferar, sendo esta mediada pelo EGFR e que este é um fator importante para a manutenção do revestimento epitelial cístico, onde a maioria dos casos analisados para o EGFR mostrou padrão de coloração membranar e citoplasmática. Foi observada correlação positiva entre os imunomarcadores. Estes resultados sugerem a participação de p63, EGFR e Notch - 1 no desenvolvimento, manutenção e integridade dos cistos epiteliais odontogênicos favorecendo a persistência da lesão.

Ressalta-se, portanto, que a distribuição do EGFR na membrana celular e/ou citoplasma indica a forma como as células irão responder a um estímulo de proliferação. Se este receptor estiver restrito à membrana da célula, a resposta de proliferação na presença do ligante circulante será rápida. Se o EGFR estiver internalizado no citoplasma, a resposta de proliferação será mais lenta. Se for observada sua presença tanto na membrana quanto no citoplasma, tem sido sugerido que a capacidade das células para responder a um estímulo de proliferação é semelhante a uma resposta do tipo fisiológica (BAUMGART et al., 2007; OLIVEIRA et al., 2011).

2.4 PODOPLANINA

A PDPN é uma glicoproteína transmembranar do tipo mucina expressa em podócitos renais humanos e é homóloga à T1α-2, um antígeno expresso sobre a superfície apical de células alveolares pulmonares do tipo I (ZUSTIN; SCHEUER; FRIEDRICH, 2010; FRIEDRICH; SCHEUER; ZUSTIN, 2012). Ela tem homólogos em humanos, camundongos, ratos, cães e hamsters e é relativamente bem conservada entre as espécies. Apresenta uma ampla variedade de funções, incluindo a regulação do desenvolvimento dos órgãos, motilidade celular, tumorigênese e metástases (ASTARITA; ACTON; TURLEY, 2012). Desde que o anticorpo monoclonal D2-40, que é anti-PDPN, tornou-se conhecido por identificar especificamente células endoteliais linfáticas, tem sido considerada como um marcador imunistoquímico importante para linfangiogênese (ZUSTIN; SCHEUER; FRIEDRICH, 2010; KREPPEL et al., 2010; OKAMOTO et al., 2010; CAETANO et al., 2012; TSUNEKI et al., 2012; TJIOE et al., 2012).

Foi identificada e estudada em diferentes contextos, por isso é conhecida por vários nomes. A primeira descrição foi em células endoteliais linfáticas como E11 e sobre as células fibroblásticas reticulares de órgãos linfóides e como GP38 em células epiteliais tímicas como. É homóloga a T1a/rTI40, um dos primeiros marcadores moleculares de células epiteliais alveolares do tipo I; PA2.26, que é