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Em linhas gerais, a espectrometria de massa (MS) é uma técnica capaz de determinar a relação entre massa e carga (m/z) de espécies ionizadas em fase gasosa (AEBERSOLD; MANN, 2003). O espectrômetro de massa é constituído por uma fonte de ionização, onde os componentes de uma amostra são convertidos em íons e imediatamente acelerados em direção ao analisador de massa; um analisador de massa, que separa os íons de

acordo com sua relação massa-carga (m/z); um detector, que recebe os íons que foram separados pelo analisador, transformando a corrente de íons em sinais elétricos que são processados, armazenados na memória de um computador e mostrados em uma tela (Figura 11).

Figura 11- Componentes básicos de um espectrômetro de massa.

Fonte: PUC-RIO.

Os dois métodos de ionização de amostras para análise proteômica por MS mais utilizados são: a ionização por eletrospray (Elelectrospray ionization, ESI) e a dessorção a laser assistida por matriz (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI) (HOFFMAN; STROOTBART, 2007).

A ionização por eletrospray (ESI), junto à ionização por MALDI, representa um dos dois métodos de ionização “suave” que têm feito a precisão, sensitividade e elegância da espectrometria de massa prontamente disponível para o estudo de biomoléculas e suas reações (FENN, 2002). Ela é hoje a técnica de ionização mais amplamente utilizada em análises químicas e bioquímicas. A interface com um espetrômetro de massa permite investigar a composição molecular de amostras líquidas (WILM, 2011). Esse método, que possui capacidade de análise de moléculas com menos de 100 Da até maiores de 1.000.000 Da e é desenvolvido à pressão atmosférica, possibilita a análise desde pequenas moléculas apolares a grandes moléculas polares, como peptídeos e proteínas (HOFFMAN; STROOTBART, 2007).

A ionização por eletrospray é um processo de transferência de íons pré-existentes em solução para a fase gasosa, envolvendo a formação de um “spray” eletrostático, a partir do qual são geradas pequenas gotas carregadas e destas são liberados os íons. Tipicamente, esta solução é bombeada através de um capilar (d.i. 50 a 100 µm) com uma vazão inferior a 10 µL/min. No caso de fluxos menores que 1 µL/min, o processo é chamado de “nanoelectrospray” (MORAES; LAGO, 2003).

Quando um potencial positivo, por exemplo, é aplicado na solução, os íons positivos tendem a se afastar para uma região menos positiva, isto é, em direção ao contra- eletrodo. Assim, a gota sendo formada na ponta do capilar estará enriquecida em íons positivos. Este tipo de separação de carga é chamado de processo eletroforético. Conforme a densidade de carga aumenta na gota, o campo elétrico formado entre o capilar e o contra eletrodo aumenta provocando a deformação da gota. A gota ganha a forma de um cone que é denominado de cone de Taylor (MORAES; LAGO, 2003).

Esta gota na forma de cone permanece “presa” ao capilar até o momento em que a densidade de carga na superfície da gota e o aumento da repulsão entre os íons vençam a tensão superficial do líquido, ocorrendo então a liberação de pequenas gotas (através de explosões coulômbicas) com alta densidade de carga. A frequência deste processo depende da magnitude do campo elétrico, da tensão superficial do solvente e da condutividade da solução (MORAES; LAGO, 2003).

A ionização por MALDI tornou-se uma ampla e poderosa fonte para a produção de íons na fase gasosa a partir de uma ampla gama de compostos de grande porte, não-voláteis e termicamente lábeis, como proteínas e oligonucleotídeos (HOFFMAN; STROOTBART, 2007).

A fonte de íons MALDI baseia-se na absorção intensa da radiação laser por uma matriz, que é misturada em solução com quantidades muito pequenas da biomolécula de interesse (o analito). A mistura matriz-analito é depositada sobre o porta amostra e secada, produzindo uma amostra sólida (FERNANDÉZ-LIMA, 2005).

Supõe-se que as funções da matriz sejam: i) absorver fortemente a radiação laser para possibilitar uma transferência eficiente da energia do pulso de radiação para o analito e ii) isolar as moléculas de analito umas das outras, para diminuir as ligações intermoleculares e permitir a dessorção intacta das moléculas. A rápida elevação da temperatura devido à interação da radiação laser com a amostra, tanto na fase sólida quanto gasosa, gera uma pressão extremamente alta na mistura matriz-analito em sublimação (FERNANDÉZ-LIMA, 2005).

Dois mecanismos são possíveis para a criação de íons no sistema matriz-analito (BAER, CHEUK-YIU, POWIS, 1997): i) ablação explosiva em clusters a partir de uma energia limiar (BEAVIS; CHAIT, 1991; BÖKELMANN, SPENGLER, KAUFMANN, 1995) e ii) expansão gasosa em jato, no qual as moléculas do analito estão dispersas dentro da matriz (KARAS, GLÜCKMANN, SCHÄFER, 2000; ZHIGUILEI et al., 1997).

Assim como há uma grande variedade de fontes de ionização, uma variedade de analisadores de massa têm sido desenvolvida. Todos os analisadores de massa usam elétrica estática ou dinâmica e seus campos magnéticos podem ser usados sozinhos ou combinados, dando origem a equipamentos classificados como híbridos, os quais fazem uso das vantagens inerentes a cada analisador. A maioria das diferenças básicas entre os vários tipos comuns de analisador de massa encontram-se na maneira pela qual esses campos são usados para conseguir a separação (HOFFMAN; STROOTBART, 2007). Quadrupolos, ion-traps (tridimensionais e lineares), Time-of-Flight (ToF), Fourier-transform ion cyclotron resonance (FT-ICR), orbitrap são exemplos de analisadores de massa. Tais equipamentos permitem que experimentos em sequência (tandem) sejam realizados, isto é, sendo possível detectar um determinado íon e posteriormente submetê-lo a uma etapa de fragmentação. Uma vez separados, esses íons são detectados por eletro multiplicadores que constituem os detectores mais largamente usados (CANTU et al., 2008).

Os programas mais comumente empregados para a identificação de proteínas em bancos de dados a partir de dados de MS são o Sequest e o Mascot. Ambos os programas correlacionam espectros de massa de fragmentação (não interpretados) de peptídeos com sequências de aminoácidos de proteínas registradas em bancos de dados (CHAMRAD et al., 2004; ELIAS et al., 2005). Além disso, esses softwares também têm a capacidade de usar sequências de nucleotídeos para fazer tal correlação. Para tal, eles primeiramente simulam as sequências primárias potenciais das proteínas correspondentes àquelas sequências de nucleotídeos encontradas nos bancos de genes, utilizando-se do código genético universal. Posteriormente, simulam a fragmentação destas sequências primárias. De forma geral, estes programas têm como objetivo encontrar a sequência de aminoácidos, em um determinado banco de dados, que melhor descreve os íons fragmentos encontrados em um espectro. As sequencias “candidatas” são procuradas nos bancos de dados de acordo com a massa do peptídeo intacto e com o espectro de fragmentação obtido para cada peptídeo (CANTU et al., 2008).

Contudo, a interpretação manual de espectros de fragmentação (sequenciamento De novo) é recomendada em todos os casos e indispensável em algumas situações. Por fim,

existem situações nas quais o genoma de uma determinada espécie ainda não está completamente sequenciado ou disponível e, neste cenário, é necessário derivar a sequência primária de aminoácidos de um determinado peptídeo baseado única e exclusivamente nos dados obtidos por espectrometria de massa, isto é, sem recorrer a banco de dados (sequenciamento De novo) (STEEN; MANN, 2004).

O potencial de aplicação da MS em estudos biológicos tem sido bastante estendido, em razão dos impressionantes avanços observados nos últimos anos nas áreas de genômica, de transcriptômica, de metabolômica, de proteômica, de lipidômica e de outras plataformas “omics”, e do desenvolvimento extraordinário dos equipamentos (FENG et al., 2008; HOFFMANN; STROOBANT, 2007). A MS é atualmente a técnica de escolha para identificação de proteínas e para estudo de modificações protéicas pós-traducionais (MPTs) em diferentes condições fisiológicas. Além disso, a MS vem sendo utilizada no monitoramento e na caracterização de diversos processos industriais, tais como processos fermentativos (ROYCE, 1993) e até mesmo análise de microrganismos intactos (CLAYDON et al.,1996; FENSELAU; DEMIREV, 2001).

A utilização da MS no estudo de lectinas vegetais permite a caracterização dessas moléculas através da determinação da massa molecular intacta, identificação do estado oligomérico, localização e caracterização de pontes de sulfeto e modificações pós- traducionais, identificação de proteínas provenientes de uma eletroforese bidimensional. Além da rapidez e relativa simplicidade de análise, outra vantagem dessa técnica é a necessidade de pequenas quantidades de amostras para realização dos estudos (SIMÕES, 2011).

Algumas lectinas de leguminosas já tiveram suas sequências primárias parcialmente determinadas por MS, entre elas Erythrina velutina (SIMÕES, 2011), Luetzelburgia auriculata (SIMÕES, 2011), Canavalia bonariensis (CALVETE, et al., 1999), Dioclea virgata (CALVETE, et al., 1999), Dioclea guianensis (CALVETE, et al., 1999), Dioclea violacea (CALVETE, et al., 1999), Dioclea rostrata (CALVETE, et al., 1999), Canavalia grandiflora (SIMÕES, 2011), Platymiscium floribundum (PEREIRA JÚNIOR, 2011).

A lectina de sementes de Vatairea macrocarpa (VML) teve a sua massa molecular e de suas cadeias determinadas por MS, além da caracterização dos glicanos N- ligados (CALVETE et al., 1998). Através desses resultados foi sugerido um mecanismo de processamento pós- traducional para essa lectina.