3.1.1 Preparo da Farinha
As sementes de Andira surinamensis foram coletadas no Campus do Pici da Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza-CE. Em seguida foram descascadas e trituradas em moinho elétrico para obtenção da farinha a partir da qual foi feita uma delipidação com hexano. A farinha fina foi acondicionada em recipientes fechados para uma posterior utilização.
3.1.2 Extração de proteínas das sementes
As proteínas solúveis foram extraídas da farinha em sulfato de amônio [(NH4)2SO4] 1 mol/L, na proporção de 1:10 (p/v), sob agitação constante por 1 h a
temperatura ambiente. A suspensão obtida foi centrifugada a 10.000 x g, temperatura 4 ºC, durante 20 min, obtendo-se assim um precipitado que foi descartado, e um sobrenadante denominado de extrato total. Esse extrato foi utilizado para realização de ensaios de atividade hemaglutinante e para o preparo de proteína em concentração pré-estabelecida, para o posterior cálculo da atividade específica.
3.1.3 Preparo da solução protéica
A concentração de proteínas solúveis no extrato total e nas diferentes frações foi preparada em mg/mL. O extrato foi preparado a uma concentração de 8 mg/mL, pela adição de sulfato de amônio [(NH4)2SO4]. As frações resultantes das cromatografias de afinidade e
troca iônica foram preparadas a uma concentração de 1 mg/mL, solubilizadas em Tris-HCl 0,1 mol/L pH 7,6 com NaCl 0,15 mol/L.
3.1.4 Atividade hemaglutinante
Os testes de atividade hemaglutinante foram realizados em tubos com o extrato protéico total e com as frações resultantes dos dois passos cromatográficos, a partir de uma adaptação ao protocolo descrito por Moreira e Perrone (1967), como descrito a seguir:
As amostras foram dispostas em duplas seriadas e diluídas em tubos (1:2, 1:4, 1:8...) em Tris-HCl 0,1 mol/L pH 7,6 acrescido de NaCl 0,15 mol/L. Para cada 100 µL da diluição foram acrescentados 100 µL de uma suspensão de hemácias de coelho e dos tipos sanguíneos A, B e O, a 2% em NaCl 0,15 mol/L, normais e tratadas com enzimas proteolíticas (papaína ou tripsina). O ensaio foi incubado a 37 °C por 30 minutos e, após esse período, deixado em repouso à temperatura ambiente por mais 30 minutos. A presença ou não de hemaglutinação foi então detectada macroscopicamente.
Os títulos de hemaglutinação foram medidos em termos de Unidade Hemaglutinante (U.H./mL) como sendo o inverso da maior diluição ainda capaz de apresentar hemaglutinação visível.
3.1.5 Cálculo da Atividade Hemaglutinante Específica
Após a obtenção do título de hemaglutinação e da concentração de proteínas solúveis, a atividade específica para cada uma das frações foi calculada, com o objetivo de se monitorar avanços na concentração/purificação da lectina em estudo.
O cálculo foi feito pela divisão do título de hemaglutinação (UH/mL) pela concentração de proteínas solúveis (mgP/mL), cujo quociente foi expresso em UH/mgP (unidades de hemaglutinação por miligrama de proteína). Esses resultados puderam ser comparados, levando à escolha da melhor condição / fração purificadora ou concentradora da atividade hemaglutinante.
A atividade hemaglutinante contra eritrócitos de coelho tratados com tripsina foi calculada a partir de diluições seriadas na base dois para determinação dos títulos de hemaglutinação. A purificação foi calculada como a relação entre a atividade hemaglutinante específica do extrato total e aquela de cada passo de purificação subsequente.
3.1.6 Especificidade por Carboidratos
A especificidade da lectina de sementes de Andira surinamensis por carboidratos foi determinada pela inibição da atividade hemaglutinante por açúcares simples e glicoproteínas, os quais foram realizados segundo protocolo adaptado a partir daquele descrito por Ramos e colaboradores (1996).
O ensaio foi conduzido em tubos de ensaio em duplicata. Foram utilizados 50 μL de soluções estoques de carboidratos a uma concentração de 0,1 mol/L ou de glicoproteínas a
uma concentração de 5 mg/mL, para diluição seriada em tampão Tris-HCl 0,1 mol/L pH 7,6 com NaCl 0,15 mol/L. No primeiro tubo de cada série foram adicionados 50 μL de uma solução de lectina em uma concentração capaz de provocar uma aglutinação de 4 U.H./mL e em seguida foram feitas diluições seriadas (1:2, 1:4, 1:8, 1:16...). O ensaio foi incubado a 37 °C por 30 minutos, e logo depois, deixado em repouso por mais 30 minutos à temperatura ambiente. Decorrido esse período, foram adicionados a cada um dos tubos 100 μL de uma suspensão a 2 % (v/v) de eritrócitos tripsinisados de coelho. O ensaio foi mais uma vez incubado a 37 °C durante 30 minutos, e logo depois, mantido em repouso por mais 30 minutos à temperatura ambiente. Os resultados foram observados macroscopicamente com 1 e 12 horas.
A inibição da atividade hemaglutinante pelos açúcares foi então verificada. Para aqueles carboidratos que se mostraram capazes de inibir a atividade hemaglutinante foi determinada a concentração mínima inibitória (CMI), a qual corresponde a menor concentração de açúcar em que permaneceu a ausência de atividade hemaglutinante.
3.1.7 Cromatografia de Afinidade em Matriz de Sepharose-Manose
O extrato total foi submetido à cromatografia de afinidade em matriz de Sepharose-Manose. Esse extrato foi centrifugado a 10.000 g, temperatura 4 ºC, durante 20 min e, em seguida, 6 mL do sobrenadante, a uma concentração protéica de 8 mg/mL, foram aplicados em uma matriz de Sepharose-Manose (2 x 3,8 cm), previamente equilibrada com uma solução de sulfato de amônio [(NH4)2SO4] 1 mol/L. A fração não retida foi lavada com a
mesma solução de equilíbrio enquanto que a fração retida foi eluída com tampão glicina 0,1 mol/L pH 2,6 adicionado de NaCl 0,15 mol/L. Frações de cerca de 1,5 mL foram coletadas manualmente. As frações foram coletadas a um fluxo de 1 mL/min e as absorbâncias forammonitoradas por espectrofotometria em um comprimento de onda de 280 nm.
As frações obtidas foram exaustivamente dialisadas contra água destilada e, então, liofilizadas. A atividade hemaglutinante, o teor de proteínas solúveis e a atividade específica de todas as frações cromatográficas foram avaliados.
3.1.8 Cromatografia de Troca Iônica em Matriz de DEAE-Sephacel
O pico retido resultante da cromatografia de afinidade foi submetido à cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE-Sephacel, uma resina com trocador
aniônico imobilizado (DEAE-dietilaminoetano). O material foi extensivamente dialisado, liofilizado, solubilizado em Tris-HCl 0,02 mol/L pH 7,6 e centrifugado a 10.000 g, temperatura 4 ºC, durante 5 min e, em seguida, 4 mL do sobrenadante, com uma concentração de proteínas de 50 mg/mL, foram aplicados em uma matriz de DEAE-Sephacel (2 x 4,5 cm), previamente equilibrada com Tris-HCl 0,02 mol/L pH 7,6. O pico não retido foi eluído com a mesma solução de equilíbrio e o pico retido foi eluído com o tampão de equilíbrio acrescido de NaCl 1 mol/L. Frações de cerca de 1,5 mL foram coletadas manualmente. As frações foram coletadas a um fluxo de 1 mL/min e as absorbâncias foram monitoradas por espectrofotometria em um comprimento de onda de 280 nm.
As frações obtidas foram exaustivamente dialisadas contra água destilada e, então, liofilizadas. A atividade hemaglutinante, o teor de proteínas solúveis e a atividade específica de todas as frações cromatográficas foram avaliados. Após esse passo obteve-se a lectina de sementes de Andira surinamensis (ASL) pura.