En reprenant la définition précédente de l’orientation des vecteurs propres des tenseurs CSA (Fig. 1.4) , nous avons calculé les angles α, β, et γ pour les deux noyaux (pour le carbone, α1 : l’angle entre −→e11 et N-C, β1 : l’angle entre −→e22 et C=O, γ1 : l’angle entre −→e33 et la normale au plan peptidique. Pour l’azote, α2 : l’angle entre −→e11 et N-C, β2 : l’angle entre −→e22 et la normale au plan peptidique, γ2 : l’angle entre −→e33et N-H) dans le cas des trois temps 20fs, 20ps et 100ps.
On remarque sur les figures 2.7 et 2.8 que l’orientation moyenne des vecteurs propres est la même quelle que soit l’échelle de temps considérée. Pour l’azote 15, on note une faible dispersion des valeurs de γ2 (au maximum, 9° d’écart par rapport à la moyenne), l’angle entre −→e33 et N-Hest donc très peu affecté alors que α2 et β2 présentent des dispersions très importantes (50° au maximum d’écart par rapport à la moyenne) et semblent donc très
(a) (b) (c)
Fig. 2.7: Orientation des tenseurs CSA 13C pour les trois temps : 20fs (a), 20ps (b), 100ps (c). Les ronds correspondent à l’angle α1 (relatif au vecteur −→e11), les triangles à β1 (relatif à −→
e22) et les croix γ1 (relatif à −→e33)
(a) (b) (c)
Fig. 2.8: Orientation des tenseurs CSA 15N pour les trois temps : 20fs (a), 20ps (b), 100ps (c). Les ronds correspondent à l’angle α2 (relatif au vecteur −→e11), les triangles à β2 (relatif à −→
e22) et les croix γ2 (relatif à −→e33)
affectés par les changements de conformations au cours de la dynamique. Pour le carbone 13, on observe des dispersions du même ordre de grandeur pour les trois angles α1, β1, γ1, autour de 10° maximum d’écart par rapport à la moyenne. Les vecteurs propres 13C sont donc, comme γ2 , peu affectés par les changements intervenant au cours de la dynamique.
Les moyennes calculées pour les 6 angles en fonction des trois temps, sont comparées dans les tableaux 2.4a et 2.4b aux valeurs calculées sur le peptide canonique. Globalement, les valeurs moyennes calculées sur les structures extraites de la dynamique sont proches des valeurs obtenues sur le peptide canonique, pour α1, β1, γ1 et γ2, allant de 1° d’écart au minimum pour γ2 à 5,3° au maximum pour α1 . En revanche, on observe des différences très importantes pour α2 et β2 , allant de 29,3° d’écart pour α2 à 40,6° pour β2 par rapport à la valeur canonique. Ceci vient corroborer les conclusions obtenues dans le paragraphe précédent, en montrant l’influence très importante des changements de structures au cours de la dynamique sur α2 et β2.
4 Importance de l’échelle de temps 13C 20fs 20ps 100ps peptide canonique !1 (degrés) 37,1 36,7 36,9 31,8 "1 (degrés) 7,4 6,9 7,0 2,4 #1 (degrés) 7,7 7,2 6,8 2,0 (a) 15N 20fs 20ps 100ps peptide canonique !2 (degrés) 57,8 50,8 50,0 20,7 "2 (degrés) 58,3 50,7 50,5 17,7 #2 (degrés) 19,7 19,7 19,5 20,5 (b)
Tab. 2.4: Moyennes des orientations des tenseurs CSA 13C (a) et 15N (b) comparées aux valeurs obtenues sur le peptide canonique
Chapitre 3
Conclusion
Nous avons mené une étude sur plusieurs trajectoires de dynamique moléculaire dont nous avons extrait un grand nombre de structures de WALP 23. Le but était d’améliorer le calcul des paramètres RMN en introduisant de nouveaux paramètres, notamment les effets dynamiques de la molécule. Pour cela, nous avons appliqué la stratégie théorique présentée dans la partie précédente en remplaçant chaque WALP 23 par une polyGLY-AL et en calculant les propriétés de RMN de toutes les polyGLY-AL. Nous avons ensuite effectué une analyse statistique de toutes ces données afin de trouver, si possible, des corrélations simples entre paramètres de RMN, paramètres structuraux et temps.
Nous avons commencé par l’analyse de 86 structures extraites au hasard de plusieurs trajectoires. Grâce à cette analyse nous avons montré une différence importante entre va- leurs moyennes calculées sur les structures de dynamique et celles obtenues sur le peptide canonique (optimisation de la géométrie et calculs de RMN utilisant la DFT), les valeurs issues de la dynamique étant très éloignées des valeurs expérimentales de RMN du solide. Nous avons également vu que les angles α2 et β2 d’orientation du tenseur CSA15N étaient fortement affectées par la prise en compte de la dynamique, impliquant des changements structuraux de la molécule. Enfin, nous avons noté des corrélations entre valeurs propres et paramètres structuraux et électromagnétiques, redémontrant l’importance de la prise en compte réseau local de liaisons hydrogène, sans toutefois avoir pu mettre en évidence des corrélations simples entre ces données.
Dans un deuxième temps, nous voulions prendre en compte les effets des modifications de structure au cours du temps, traduisant notamment des mouvements moléculaires internes. Nous avons commencé par travailler sur 500 structures extraites toutes les 140ps. Nous avons obtenu les mêmes conclusions que précédemment avec les 86 structures. Ceci implique qu’il n’est pas nécessaire, pour décrire correctement les tenseurs CSA, de prendre en compte des mouvements moléculaires lents. De plus, ceci nous indique qu’un travail sur une centaine de structures est suffisant, et surtout moins coûteux en temps de calcul.
des mouvements internes beaucoup plus rapides, tels que les vibrations. Pour cela, nous avons étudiés les paramètres de RMN de structures extraites toutes les 20fs, 20ps, et 100ps. Les valeurs propres moyennes et les orientations des vecteurs propres présentaient les mêmes caractéristiques que précédemment.
Nous avons montré qu’il existait une forte corrélation entre paramètres structuraux et RMN mais nous n’avons pas réussi à faire ressortir des règles simples de cette étude. Nous supposons qu’il existe en fait des relations complexes entre tous ces paramètres. Au final, nous avons déduit de cette dernière partie, qu’un tel travail pouvait être mené sur une simulation courte (10ps), pour un nombre restreint de structures (une centaine).
Ce travail a mis en évidence, dans le cas où l’on souhaite déterminer précisément des paramètres RMN, certains problèmes liés à l’utilisation de la dynamique moléculaire et des champs de force actuels. En effet, nous avons obtenue des valeurs très éloignées des valeurs expérimentales, notamment pour la valeur propre σ22 du 13C.
Cette valeur étant intimement liée à la description du réseau de liaisons hydrogène, nous en avons conclu que celui-ci était mal représenté dans le calcul RMN. Nous pensons que ceci pourrait être dû à une mauvaise description du réseau de liaison hydrogène lors du calcul utilisant le champ de force ou encore d’un problème d’ « optimisation » des liaisons lors de la phase d’équilibre en début de simulation.
Cette dernière hypothèse a pu être éliminée lors de l’étude sur les dynamiques à temps courts pendant lesquelles les liaisons avaient été « optimisées » durant cette première phase d’équilibre. En effet, nous avons pu mesurer des longueurs de liaisons, sur les structures extraites de ces dynamiques, identiques à celles obtenues sur le peptide canonique. Les distances des liaisons C=O et N-H impliquées dans les liaisons hydrogène ne semblent donc pas avoir d’influence importante sur les tenseurs CSA.
Ceci nous a conduit à privilégier la deuxième hypothèse, d’autant plus que l’on sait que les champs de force ne prennent pas en compte les effets d’anharmonicité, ce qui pourrait expliquer le problème de description des liaisons. La prise en compte de l’anharmonicité dans le champ de force pourrait donc palier ce problème.
Conclusion générale et Perspectives
Ce travail de thèse avait pour objectif de répondre à deux grandes questions :
1. Est-on capable de développer une méthodologie afin de définir l’orientation et la dy- namique de peptides transmembranaires ?
2. Est-il possible, à l’aide des outils de chimie quantique actuels, de décrire correctement les tenseurs CSA de noyaux15N et13C (carbonyle) situés sur le squelette peptidique de tels systèmes ? Si oui, quels sont les éléments indispensables à une description précise ? Durant ces 3 années, nous nous sommes efforcés de répondre à ces problématiques. A cette fin, nous avons utilisé la RMN en combinant calculs quantiques de tenseurs CSA statiques et expériences de RMN du solide . Nous avons choisi de travailler sur le peptide WALP 23. Ce peptide, structuré en hélice α, avait déjà fait l’objet d’études visant à définir son orientation au sein de membranes.
Nous avons voulu compléter ces études préalables en prenant en compte la dynamique de ce système au sein de la bicouche lipidique. C’est pourquoi nous avons développé un modèle dynamique à 4 paramètres, définissant ainsi l’orientation du peptide à l’aide des paramètres τ (inclinaison du peptide par rapport à la normale à la bicouche) et ρ (rotation de l’hélice au sein de la membrane) et sa dynamique à l’aide des paramètres ∆τ (variations d’inclinaison de l’hélice) et ∆ρ (oscillation du peptide). Afin de déterminer ces quatre inconnues, un certain nombre de contraintes RMN étaient nécessaires. Nous avons montré qu’il était suffisant de ne prendre en compte que 2 types d’interaction : les éclatements quadripolaires 2H des méthyles des alanines et les anisotropies de déplacement chimique (CSA) 15N (amide) et 13C (carbonyle).
Expérimentalement, il était possible d’avoir accès aux éclatements quadripolaires, aux CSA dynamiques (du peptide en membrane) et aux tenseurs CSA statiques (sur des échan- tillons en poudre). Cependant, avec le type d’échantillon dont nous disposions, il était impos- sible expérimentalement d’obtenir les orientations des vecteurs propres des tenseurs CSA. La chimie quantique a donc joué un rôle crucial dans ce travail en apportant la réponse à ce problème.
La première étape de ce travail a donc consisté à calculer précisément les tenseurs CSA statiques en utilisant la DFT, ceci afin de nous permettre d’obtenir les composantes de ces tenseurs i.e. les valeurs propres et surtout les orientations des vecteurs propres. Pour ce faire, nous avons travaillé sur la structure canonique du peptide hélicoïdal WALP 23 (Acétyl-GW2(LA)8LW2A–NH2). Expérimentalement, nous disposions d’un peptide marqué 13C sur l’alanine 13 et 15N sur la leucine 14. Nous avons donc calculé les tenseurs CSA de ces deux acides aminés à partir de la structure canonique. Ainsi, nous avons pu comparer les valeurs propres théoriques aux valeurs expérimentales. Ceci nous a permis de mettre en évidence que la bonne reproduction du réseau de liaisons hydrogène d’une hélice α était nécessaire à la bonne description des tenseurs de noyaux situés sur le squelette peptidique.
Notamment, nous avons remarqué que la valeur propre σ22 était très affectée par la prise en compte, ou non, de l’intégralité de ce réseau. Nous avons ensuite remplacé le peptide WALP 23 par une polyGLY-AL dans laquelle tous les acides aminés de WALP ont été remplacés par des glycines exceptés les acides aminés contenant les noyaux d’intérêt (alanine 13 et leucine 14). Ceci nous a permis d’observer qu’il était nécessaire et suffisant, pour la bonne description des tenseurs de ces noyaux, de ne conserver que les acides aminés concernés, étant donné que les résultats obtenus pour la polyGLY-AL étaient sensiblement les mêmes que ceux obtenus sur WALP 23. A ce niveau, la chimie théorique est capable d’apporter des informations parfois difficile voire impossible d’accès pour les expérimentateurs.
Grâce à une analyse de type MACADAM (Multiple Anisotropic Constraints and Dy- namical Analysis of Membrane protein), combinant valeurs des orientations des vecteurs propres des tenseurs CSA obtenus par chimie quantique et données expérimentales de RMN solide (éclatements quadripolaires 2H des méthyles des alanines, CSA 15N et 13C’), appli- qué au modèle dynamique à 4 paramètres, nous avons obtenu l’orientation et la dynamique de WALP 23 en membrane de DMPC. Ces résultats ont montré que le peptide s’incline de τ = 22° et effectue une rotation de ρ = 150° au sein de la membrane. Ses oscillations (∆ρ = 90°) témoignent du caractère dynamique du peptide dans la bicouche lipidique. Nous avons également montré que ces oscillations avaient un effet non-négligeable sur l’angle d’inclinaison. Il est donc nécessaire de prendre en compte cette dynamique pour décrire cor- rectement l’orientation du peptide dans la membrane. Ceci vient donc lever la controverse sur la valeur de l’angle τ donné par la dynamique moléculaire (∼ 30°) et celui obtenu à l’aide de la méthode GALA (∼ 5°) avec un modèle semi-statique. Ce dernier ne prenant pas en compte les effets de dynamique, la valeur de l’angle τ était donc minimisée.
Nous avons ensuite voulu vérifier la validité de notre méthodologie sur un peptide si- milaire à WALP 23 : GALP 23, présentant une diffusion axiale sur lui-même. Nous avons appliqué l’analyse MACADAM sur un modèle dynamique à seulement 2 paramètres cette fois : l’angle d’inclinaison τ du peptide par rapport à la normale à la bicouche et son pa- ramètre d’ordre moléculaire Smol. Nous avons montré que le peptide GALP 23 s’inclinait
moins (3°) et était donc moins dynamique que le peptide WALP. Cette étude a également démontré que la méthodologie mise en place pour déterminer l’orientation et la dynamique de WALP en membrane pouvait être appliquée à d’autres peptides. Ceci venant du fait que l’analyse MACADAM permet de prendre en compte plusieurs interactions, dont les tenseurs sont orientés différemment.
L’étude sur GALP a également permis de mettre en évidence les effets des variations d’orientations des vecteurs propres sur le calcul de τ et Smol. Nous avons émis l’hypothèse
Conclusion générale et Perspectives
que ces variations pourraient être dues à des modifications locales de la structure du peptide. C’est pourquoi nous nous sommes intéressés, dans une dernière partie, à l’influence de ces facteurs structuraux sur les tenseurs CSA. Pour cela, nous avons combiné calculs quantiques et dynamique moléculaire.
Nous avons extrait des structures de WALP 23 en membrane de DMPC à partir de trajectoires calculées par P. Fuchs. Nous avons ensuite effectué le même type de calcul que celui réalisé dans la première partie sur la structure canonique de WALP afin d’extraire les tenseurs CSA 13C de l’alanine 13 et 15N de la leucine 14.
Nous avons montré que les orientations des tenseurs CSA15N étaient affectés par la prise en compte de la dynamique, impliquant des changements structuraux locaux. De plus, nous avons pu noter qu’il existait des corrélations complexes entre valeurs propres et paramètres structuraux et électromagnétiques étant donné que nous avons pu observer des corrélations entre tous ces paramètres, sans avoir pu mettre en évidence des règles simples.
Dans la continuité de ce travail, on pourrait envisager d’appliquer cette méthodologie à d’autres types de peptides (ayant des séquences d’acides aminés différents). Par exemple, il serait intéressant de regarder les effets d’acides aminés chargés (tels que les lysines ou les asparagines) sur le calculs des tenseurs CSA. Il serait également intéressant de regarder les effets de déformation des hélices α, notamment, il est connu que ces hélices peuvent se plier ou se casser au niveau de certains acides aminés tels que les prolines. Les effets de la structure secondaire sur les valeurs propres et les vecteurs propres seraient également inté- ressants à analyser. Nous avons vu que le réseau de liaisons hydrogène des hélices α était essentiel à la bonne description des tenseurs RMN. On pourrait donc analyser l’influence de tels réseaux dans les hélices π, 310 ou même les feuillets β.
Avec des moyens informatiques plus performants, il serait aussi envisageable d’étudier les effets intramoléculaires. Cependant, les ressources informatiques dont nous disposons ne permettraient pas, à l’heure actuelle, de calculer, en utilisant la DFT, les tenseurs CSA de si grands systèmes systèmes. Les protéines membranaires sont consitutées de plusieurs types de structures secondaires en interactions les unes avec les autres. Il serait donc intéressant de prendre en compte les effets de chacun de ces éléments sur les autres. Dans un premier temps, il serait judicieux de commencer par étudier seulement un nombre restreint d’hélices d’une même protéine.
Avec les moyens adaptés et pour prendre en compte les effets structuraux et dynamiques, il serait intéressant d’utiliser la combinaison calculs quantiques/dynamique moléculaire. Les structures pourraient être obtenues par dynamique moléculaire, permettant ainsi de prendre en compte l’intégralité du systèmes (protéine + lipides) et de simuler ainsi la dynamique du peptide/de la protéine dans son environnement « naturel ». Pour cela, le système, ou la
partie d’intérêt, devrait être traité avec un niveau de calcul élevé (HF ou DFT par exemple) à la place du champ de force. On pourrait alors utiliser une méthode hybride (de type ONIOM) pour traiter l’intégralité du système. La partie d’intérêt serait traitée avec un niveau de calcul élevé et le reste du peptide/de la protéine, simulant l’environnement, avec un niveau de calcul moindre. Le calcul des paramètres RMN se ferait ensuite à l’aide de calculs quantiques, comme nous l’avons fait dans ce travail.
Annexe
Dans cette partie, nous présentons les figures relatives à la partie « Calculs de tenseurs CSA : apport de la dynamique moléculaire », et au chapitre 2 « Analyse temporelle ».
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
Fig. 1: Evolution des angles plans autour du carbonyle (alanine 13) (a, c, e) et de l’azote (leucine 14) (b, d, f) au cours de la simulations de 70ns (échelle de temps en ps)
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
Fig. 2: Influence des angles plans autour du carbonyle sur la valeur propre σ22 du13C et des angles plans autour de l’azote sur σ22 du 15N pour les 484 polyGLY-AL.
ANNEXE
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
Fig. 3: Influence de la charge totale du peptide sur les valeurs σ11− σiso, σ22− σiso, σ33− σiso
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