transparentes Expressão aumentada nos variantes opacos
Ácido teicóico (Kim e Weiser, 1998). Polissacárido capsular (Kim e Weiser, 1998).
Autolisina A (LytA) (Weiser et al., 1996).
Proteína A de superfície (PspA) (Kim e Weiser, 1998).
Proteína A de ligação à colina
(CbpA) (Rosenow et al., 1997). Factor de elongação (EF-Ts) (Overweg et al., 2000). Piruvato oxidase (Spbx) (Spellerberg
et al., 1996; Overweg et al., 2000). Proteína A de maturação (PpmA)
(Overweg et al., 2000).
Bacteriocinas (King et al., 2004).
Neuraminidase A (NanA) (King et al., 2004).
β-Galactosidase (BgaA) (King et al., 2006).
β-N-acetilglucosaminidase (StrH) (King et al., 2006).
Ácidos gordos insaturados na membrana plasmática (Aricha et al.,
2004).
Em seguida abordaremos estas estruturas, à excepção da CbpA e da PspA que já foram referidas anteriormente. Vai ser incluída a pneumolisina, porque é um dos factores que se pensava exibir variação de fase.
Ácido teicóico
O ácido teicóico é importante na manutenção da integridade estrutural da parede celular. Uma propriedade recentemente atribuída ao ácido teicóico é a presumível ligação a resíduos de D-alanina que reduzem a carga negativa da célula repelindo a ligação dos antimicrobianos catiónicos (Kovacs et al., 2006).
Em 1998 demonstrou-se que a variação de fase está associada a uma variação na expressão de ácido teicóico e de polissacárido capsular, havendo uma relação inversa entre a expressão dos dois carbohidratos nestes variantes, o que sugere uma interdependência na sua expressão superficial (Kim e Weiser, 1998).
Em 1999 verificou-se que as diferenças qualitativas, nomeadamente o tipo da cápsula, e a presença ou ausência de polissacárido capsular, não afectam a quantidade do ácido teicóico associado à célula. Por outro lado, as diferenças quantitativas não perturbam o conteúdo do polissacárido associado à célula, mas as diferenças estruturais sim. Quando uma estirpe cresce num meio com etanolamina, um análogo da colina, apresenta uma maior quantidade de polissacárido capsular do que a que cresce num meio com colina, sendo esta quantidade sempre maior nos variantes opacos do que nos transparentes (Kim et al., 1999).
Estes resultados revelam que o ácido teicóico pode ser um factor importante na expressão da cápsula, mas a regulação da expressão destes dois carbohidratos e a sua interdependência não está ainda inteiramente esclarecida.
Não contrariando os resultados acima descritos há indícios de haver uma relação entre o polissacárido capsular e o ácido teicóico:
- Ambos estão ligados covalentemente ao peptidoglicano estando indirectamente ligados um ao outro (Fischer, 1997).
- Algumas cápsulas polissacarídicas têm na sua estrutura fosforilcolina, o que sugere que esta tenha sido originada como uma forma modificada do ácido teicóico (Fischer, 2000).
- Os variantes transparentes expressam pelo menos duas vezes mais ácido teicóico do que os variantes opacos, e estes expressam até 5 vezes mais polissacárido capsular do que os variantes transparentes (Kim e Weiser, 1998).
Sendo o ácido teicóico um factor de virulência pneumocócico esperava-se que a expressão deste carbohidrato variasse de acordo com a origem das estirpes. Contudo, Spreer et al. (2004) verificaram pela técnica de imuno-ensaio que a quantidade de ácido teicóico e lipoteicóico é semelhante entre as estirpes responsáveis por infecções invasivas, não invasivas e de colonização. Observaram também que a expressão e libertação de ácido teicóico e de ácido
que indica haver outros factores que expliquem as diferenças de invasibilidade e patogenicidade nestas estirpes (Spreer et al., 2004).
Polissacárido capsular
Alterações na produção de polissacárido capsular podem ser obtidas, quer pela duplicação de genes do locus capsular levando à ausência de cápsula (Waite et al., 2001; 2003) quer pelo fenótipo de opacidade através de um mecanismo não clarificado que conduz a uma maior ou menor produção de cápsula (Weiser et al, 2001).
È possível que ambas ocorram in vivo dependendo das condições do meio.
Descreve-se, mais pormenorizadamente, as duas maneiras diferentes de alterações na produção de polissacárido capsular:
a) Os locus capsulares têm uma estrutura similar em todos os serótipos à excepção do 3 e 37
(Waite et al., 2003). O locus capsular tem uma região central com um número variável de genes cps específicos a cada tipo capsular, um gene cpsE, que é a transferase do primeiro monossacárido, e uma região de regulação e exportação da cápsula que envolve 4 genes cpsA,B,C e cpsD localizados a montante do cpsE (Guidolin et al., 1994). Waite et al. (2003) descreveram o fenómeno de variação de fase capsular nos serótipos 8 e 37 que envolve os genes cps e tts, respectivamente. A duplicação espontânea duma sequência leva à ausência de produção da cápsula que volta a ser produzida após a excisão dessa duplicação. Este mecanismo é análogo ao encontrado no serótipo 3 (Waite et al., 2001) e noutros serótipos (Guidolin et al., 1994; Kolkman et al., 1996; Morona et al., 2000) e tem uma elevada frequência de reversão (Waite et al., 2001; 2003).
As estirpes sem cápsula têm sido associadas à ocorrência de conjuntivite desde 1977 por Finland e Barnes. Estudos recentes confirmam estas estirpes como sendo as responsáveis por surtos (Carvalho, 2003) e casos esporádicos (Bérron et al., 2005; Porat et al., 2006) de conjuntivite. Ocasionalmente têm sido implicadas noutras infecções pneumocócicas como a otite média e infecções invasivas (Bérron et al., 2005). A ausência de cápsula parece conferir uma vantagem selectiva para causar conjuntivite. Contudo, não se sabe se os pneumococos não tipáveis nunca produzem cápsula ou se perdem a capacidade de a produzir usando a variação de fase quando causam infecção conjuntiva.
b) Os variantes opacos expressam maior quantidade de polissacárido capsular do que os
variantes transparentes (Kim et al., 1999). Está envolvida uma regulação diferencial da expressão dos gene cps do loci do polissacárido capsular (Morona et al., 2000; Weiser et al.,
2001). Um dos mecanismos de regulação envolve a fosforilação da proteína CpsD e a concentração de oxigénio no meio (Weiser et al., 2001).
A fosforilação de dois ou mais resíduos de tirosina na proteína CpsD promove o aumento da actividade reguladora negativa desta proteína sobre a biossíntese de polissacárido capsular diminuindo a sua produção (Weiser et al., 2001). Em condições de concentração reduzida em oxigénio a expressão do polissacárido capsular é aumentada nos variantes opacos e mantém-se baixa nos variantes transparentes. Demonstrou-se que a condição de microaerofilia, quando comparada com a condição atmosférica, é suficiente para induzir um aumento significativo na expressão de polissacárido capsular, e que a condição de anaerobiose estrita promove uma estimulação máxima da produção de cápsula. Weiser et al. (2001) especulam que durante a pneumonia e durante a otite média há uma limitação na troca de gases, o que leva a uma diminuição da concentração de oxigénio no espaço alveolar e no exsudado inflamatório no ouvido médio, respectivamente. Cria-se assim, durante a infecção, condições apropriadas para a selecção dos variantes opacos.
O conhecimento sobre os mecanismos envolvidos na produção do polissacárido revelou-se ainda mais importante depois de se ter estabelecido uma relação directa entre a quantidade de polissacárido capsular e a eficiência na fuga à fagocitose. Numa experiência realizada na presença da forma purificada da proteína C reactiva humana, em concentrações geralmente encontradas numa infecção e na ausência de anticorpos capsulares, verificou-se que há um aumento da actividade opsonofagocítica contra os variantes transparentes, mas não há uma alteração desta actividade contra os variantes opacos. Os resultados sugerem que a pCr pode ser um factor significativo na opsonização dos variantes transparentes e pode explicar a reduzida virulência deste fenótipo. Esta hipótese é concordante com os estudos que demonstraram que os variantes transparentes ligam mais pCr através da fosforilcolina. Por outro lado, o facto da actividade opsonofagocítica não ter sido alterada contra os variantes opacos, e de se terem observado excepções nalguns serótipos, indica que a quantidade e a estrutura do polissacárido capsular pode influenciar o papel da proteína C reactiva (Kim et al., 1999). Com base nestes resultados foi possível sugerir que a maior virulência dos variantes opacos está relacionada com o aumento da expressão de polissacárido capsular.
Autolisina A
A autolisina A, LytA, é a enzima amidase N-acetilmuramuil-L-alanina (Howard e Gooder, 1974) à qual se deve maioritariamente a autólise pneumocócica (Berry et al., 1989). Durante a
autólise os elementos da parede celular e da célula são libertados, podendo ter um efeito indirecto na capacidade da bactéria se evadir à fagocitose, e potencialmente causar infecção.
Em 1986, Garcia et al. descobriram que no mecanismo de secreção da enzima está ausente a sequência sinal típica dos procariotas (Garcia et al., 1986).
Em 1996, verificou-se que a expressão da LytA difere de acordo com o fenótipo da estirpe observando-se maiores expressões da enzima nos variantes transparentes. Neste estudo onde se compararam propriedades de crescimento entre variantes transparentes, opacos e estirpes mutantes com o gene lytA inactivo, verificou-se que os três grupos de estirpes entram na fase estacionária ao mesmo tempo. Tanto os variantes opacos como os mutantes LytA- entram na fase estacionária com uma absorvância superior à dos variantes transparentes, não sofrendo autólise numa frequência considerável depois de entrarem nesta fase. Os autores concluíram que a menor quantidade de expressão da LytA nos variantes opacos é o factor com maior responsabilidade na menor frequência de autólise neste fenótipo (Weiser et al., 1996).
Em 1995, Saluja e Weiser tinham já constatado que os variantes opacos, tal como as estirpes LytA-, são resistentes aos efeitos do desoxicolato e que na sua presença a adição de LytA a culturas de variantes opacos não é suficiente para causar a lise, indicando haver outras diferenças estruturais que podem alterar a susceptibilidade do substrato da parede celular à degradação autolítica contribuindo para a resistência dos variantes opacos à lise celular (Saluja e Weiser, 1995; Weiser et al., 1996).
Pneumolisina
A pneumolisina é uma toxina formadora de poros que está presente no citoplasma. Ela é libertada durante o crescimento exponencial, independentemente da lise celular e da autolisina (Balachandran et al., 2001) ou na lise celular generalizada no início da fase estacionária (Berry et al., 1989).
Em 1998 verificou-se que os variantes transparentes e opacos expressam quantidades semelhantes de pneumolisina, tornando improvável que a pneumolisina seja responsável pela maior virulência dos variantes opacos (Kim e Weiser, 1998). Mais tarde Spreer et al. (2004) utilizando a técnica de “immunoblotting” mostraram que a quantidade de pneumolisina extracelular é semelhante entre as estirpes responsáveis por infecções invasivas, não invasivas e de colonização. O mesmo se passa com a quantidade de pneumolisina no citoplasma. Adicionalmente observou-se que a produção de pneumolisina é independente do serótipo e que durante o crescimento in vitro não há diferenças na expressão e libertação de pneumolisina entre estirpes responsáveis por infecções invasivas, não invasivas e estirpes de colonização.
Noutro trabalho desenvolvido por Benton et al. (1997), descobriu-se que as diferenças na virulência dos pneumococos em modelos de infecção em ratinhos não se devem a diferentes quantidades de pneumolisina.
Em conjunto, estes resultados indicam que a produção e a libertação desta toxina não são suficientes para explicarem as diferenças de patogenicidade entre as estirpes (Benton et al., 1997; Spreer et al., 2004).
Piruvato oxidase
A enzima piruvato oxidase, SpbX faz a descarboxilação do piruvato em acetil fosfato, resultando na libertação de H2O2 e CO2.
Em 1996 observou-se que os mutantes pneumocócicos de SpbX não produzem virtualmente nenhum peróxido de hidrogénio e não colonizam eficientemente a nasofaringe (Spellerberg et al., 1996).
Em 2000 verificou-se que os variantes transparentes produzem maiores quantidades de H2O2 e relacionou-se este facto com a maior expressão de piruvato oxidase nestes variantes (Overweg et al., 2000). Em conjunto estes resultados sugerem que a expressão diferencial da enzima SpbX pode conferir aos variantes transparentes uma maior eficiência em aderirem à superfície das células do hospedeiro (Spellerberg et al., 1996; Overweg et al., 2000).
Foi estabelecido também que a expressão da piruvato oxidase é influenciada pela concentração de O2 no meio (Overweg et al., 2000). Provavelmente a concentração de O2 em condições atmosféricas vai coadjuvar a reacção de descarboxilação do piruvato promovendo a expressão da enzima que catalisa esta reacção. Segundo Weiser et al. (2001) nestas condições os variantes transparentes são seleccionados e, de acordo com Overweg et al. (2000), estes variantes expressam mais SpbX o que promove a aderência ao hospedeiro.
Proteína de maturação PpmA e factor de elongação EF-Ts
A proteína PpmA é expressa em maior quantidade nos variantes transparentes, o que sugere que esteja envolvida directamente na aderência, através da maturação de proteínas de superfície com propriedades de aderência, ou indirectamente pela activação de proteases ou outras proteínas secretadas (Overweg et al., 2000). Esta proteína é também capaz de despoletar a resposta imunitária (Overweg et al., 2000a).
O factor de elongação EF-Ts é essencial no alongamento da cadeia polipeptídica durante a síntese proteica. É possível que a maior produção de EF-Ts nos variantes opacos indique que estes sejam metabolicamente mais activos, o que pode explicar o rápido crescimento destes
Exoglicosidases NanA, BgaA e StrH
Conhecem-se três neuraminidases, a NanA, a NanB e a NanC. Todas as estirpes isoladas de crianças parecem ter o gene nanA, 96% o nanB e apenas 51% o nanC. A maioria das estirpes tem a combinação nanA e nanB e a combinação nanA, nanB e nanC. Embora a NanA e NanB sejam essenciais no modo de vida das estirpes causadoras de infecções invasivas e de colonização promovendo a aderência às células do hospedeiro, a presença da NanC parece predispor para a infecção invasiva do líquido cefalorraquidiano (Pettigrew et al., 2006).
Em 2000 verificou-se que a neuraminidase NanA contribui para o desenvolvimento da otite média num modelo de chinchila provavelmente por facilitar a aderência à traqueia da chinchila como demonstrado ex vivo (Tong et al., 2002).
Em 2004 demonstrou-se que os variantes transparentes expressam maior quantidade de NanA envolvida na promoção da aderência. Através da análise genética por “microarrays” de 2129 grelhas abertas de leituras constatou-se que os variantes transparentes expressam maior quantidade das neuraminidases NanA e NanB. Verificou-se que o gene nanA é regulado positivamente pelos variantes transparentes e que as diferenças na expressão de nanA atingem um máximo na fase estacionária. Enquanto que o gene nanB, que se situa num regulão diferente, tem a mesma expressão em ambos os variantes (King et al., 2004).
Em 2006 foi possível concluir que para além da NanA os variantes transparentes de estirpes do serótipo 6A produzem maior quantidade de β-galactosidase e de N-β-acetilglucosaminidase do que os opacos, conferindo-lhes uma maior capacidade de aderência e colonização da nasofaringe humana (King et al., 2006). Contudo, em estirpes do serótipo 6B não se verificaram diferenças na actividade destas duas enzimas nos variantes transparentes, o que sugere que nalgumas estirpes a actividade da enzima NanA pode ser a única responsável pela exposição da manose das glicoproteínas do hospedeiro.
Bacteriocinas
As bacteriocinas são pequenos péptidos antimicrobianos produzidos por uma grande variedade de bactérias e que estão envolvidos na competição intra e inter-específica. Tipicamente as bacteriocinas têm como alvo microrganismos da mesma espécie ou de espécie próxima. A produção duma proteína específica protege a bactéria produtora da bacteriocina do seu efeito inibidor. Esta proteína é co-transcrita com os genes que codificam o péptido (de Saizieu et al., 2000).
Em 2000 foi identificado um locus blp pneumocócico que codifica alguns péptidos tipo bacteriocinas (de Saizieu et al., 2000). Em 2006 constatou-se que a regulação do locus é
complexa, provavelmente envolvendo um sistema regulador, uma feromona peptídica e um transportador (Dawid et al., 2007).
No estudo de Dawid et al. (2007), não foi possível constatar in vitro qualquer actividade mensurável relacionada com as bacteriocinas das estirpes R6 e TIGR4. Contudo identificaram-se duas estirpes causadoras de infecção dos serótipos 6A e 19A com esta actividade.
Confirmou-se que na estirpe 6A a actividade inibitória é regulada pelo sistema regulador do locus e requer os dois genes putativos das bactericionas blpM e blpN. Esta estirpe tem capacidade de inibir a estirpe TIGR4 porque as diferenças entre as bacteriocinas produzidas pelas duas estirpes são suficientes para resultarem na falha da proteína imunitária da TIGR4 para se proteger contra as bacteriocinas da estirpe 6A. As bacteriocinas da estirpe 6A e da TIGR4 são diferentes em apenas 5 amino ácidos e pertencem cada uma a um subtipo de BlpMN. Há assim dois tipos de BlpMN, um é semelhante à proteína da estirpe TIGR4 e outro é homólogo à proteína do serótipo 6A. Mas nem todas as estirpes pneumocócicas já sequenciadas possuem bacteriocinas homólogas às BlpMN, um exemplo é a estirpe R6 (Dawid et al., 2007).
A estirpe 19A foi usada num modelo de colonização murino e concluiu-se que as bacteriocinas BlpMN têm de facto um papel relevante na competição intra-específica na nasofaringe. As bacteriocinas podem remover eficientemente os competidores da nasofaringe aumentando potencial para a transmissão da bactéria a outros hospedeiros. Contudo, o serótipo 19A emergiu na era pós vacinação como um serótipo importante como causador de infecções invasivas, o que sugere que poderá haver uma relação entre a produção de bacteriocinas, a capacidade para colonizar a nasofaringe e causar infecção invasiva.
Em 2004 já se tinha verificado que os variantes transparentes expressam mais intensamente as orfs homólogas às orfs da estirpe TIGR4 envolvidas na produção de bacteriocinas (King et al., 2004). Dawid et al. (2007), descreveram que o variante transparente da estirpe 6A tinha uma actividade inibitória muito menor do que o variante opaco mas não apresentava diferenças na imunidade. Esta aparente contradição pode resultar de diferenças na transcrição entre os variantes transparentes e opacos (King et al., 2004).
Se os resultados acima descritos se aplicarem a um maior número de variantes fenotípicos é de crer que a maior expressão de bacteriocinas pelos variantes opacos possa conferir vantagem selectiva na invasão das células do hospedeiro.
Lípidos membranares
O locus da opacidade está associado a genes presumivelmente envolvidos no metabolismo da membrana plasmática (Saluja e Weiser, 1995). A partir desta proposição, Aricha et al. (2004)
tentaram relacionar a variação de fase com a síntese de fosfolípidos membranares e verificaram que os variantes pneumocócicos exibem diferentes níveis de insaturação nos fosfolípidos membranares.
A membrana celular dos pneumococos é formada por uma camada dupla composta por vários fosfolípidos, glicolípidos e proteínas (Tomasz e Fischer, 2000). As alterações na composição lipídica da membrana tal como o grau de insaturação das cadeias, o comprimento e grau de ramificação das cadeias, alteram as características biofísicas da membrana.
No estudo de Aricha et al. (2004) verificou-se que os variantes transparentes e opacos têm o mesmo conteúdo lipídico mas diferentes níveis de insaturação dos ácidos gordos. Nos variantes transparentes a razão entre ácidos gordos insaturados e os saturados é maior do que nos opacos, o que pode explicar a menor microviscosidade membranar observada nestes variantes.
A variação do nível de insaturação dos ácidos gordos entre os variantes opacos transparentes pode resultar da adaptação homeoviscosa. A adaptação homeoviscosa, segundo Sinensky (1974), é o processo no qual as alterações na temperatura ou na pressão hidrostática induzem modificações na actividade das enzimas envolvidas no metabolismo de ácidos gordos, fazendo com que se altere a proporção de ácidos gordos insaturados nos fosfolípidos membranares.
Nos diferentes nichos no hospedeiro humano as condições de temperatura, concentração de O2 e CO2 e pH alteram-se. De acordo com os autores, o menor número de ligações duplas nos ácidos gordos nos variantes opacos deve conferir uma vantagem adaptativa durante a invasão de fluidos geralmente estéreis em condições de stress oxidativo, decrescendo a sua susceptibilidade à peroxidação dos lípidos (Aricha et al., 2004).
Noutro estudo, Sahu et al. (2006), usaram a espectroscopia de FTIR (“Fourier Transform InfraRed”) que, em combinação com outros métodos, possibilita distinguir diferentes espécies bacterianas, serótipos, e diferentes quantidades capsulares em pneumococos. Na análise quantitativa verificaram que os variantes opacos possuem uma maior quantidade de carbohidratos da cápsula do que os variantes transparentes. Na análise qualitativa observaram que os variantes têm conteúdos lipídicos distintos, contradizendo o estudo anterior, mas não refutam a existência de diferenças a nível da insaturação.
Os dados indicam ainda que na maioria das estirpes grande parte das proteínas celulares dos variantes transparentes e opacos é similar. Os variantes opacos e transparentes de estirpes do serótipo 6A são uma excepção pois apresentam pequenas diferenças no seu conteúdo lipídico e disparidade a nível das proteínas celulares (Sahu et al., 2006).
Estes dois trabalhos vieram comprovar que a maioria dos variantes fenotípicos pneumocócicos se diferenciam ao nível dos lípidos membranares e dos carbohidratos da cápsula.
Modelo de invasão da mucosa da nasofaringe
Recentemente Briles et al. (2005), conceberam um modelo no qual durante a colonização da nasofaringe o S. pneumoniae forma duas populações, uma que continua a colonizar a nasofaringe e outra que invade a mucosa da nasofaringe sem causar sintomas de infecção.
Este modelo resulta de experiências com ratinhos nas quais se verificou o aparecimento de variantes transparentes quando a superfície nasal era lavada com solução salina. Quando o tecido nasal era lavado por homogeneização observavam-se maioritariamente variantes opacos. Isto indica que os variantes opacos invadem o tecido nasal. Contudo, os próprios autores ressalvam que os produtos da superfície dos pneumococos podem ter causado a inflamação.
O modelo defende que uma sub-população pneumocócica invade a mucosa nasal para a