O principal objetivo deste trabalho foi a identificação de mecanismos responsáveis pela regulação pós-transcricional dos genes das glicoproteínas estágio-específicas GP82 e GP90 de Trypanosoma cruzi (Teixeira & Yoshida, 1986; Araya et al., 1994; do Carmo et al., 2002). Nossos resultados indicam que os mecanismos que regulam os níveis de RNAm GP82 e GP90 são complexos, envolvendo elementos da 3’-UTR (região não-codificadora) e mobilização para os polissomos. Além disso, os dados sugerem que diferentes características, como a presença de motivos específicos nas seqüências da 3’-UTR ou conformação estrutural, estejam envolvidas na regulação da expressão gênica.
Os níveis de RNAm GP82 e GP90 são superiores em tripomastigotas metacíclicos do que em epimastigotas, como mostrado em experimentos de “northern blot” (Araya et al., 1994; do Carmo et al., 2002). Para verificar que nível estes genes estariam sendo regulados, analisamos a transcrição pela técnica de “run-on”. Verificamos que as taxas de iniciação da transcrição dos genes GP82 e GP90 em epimastigotas e tripomastigotas metacíclicos são comparáveis (Fig. 2). O mesmo foi observado para o gene Tc85, outro membro da família das TS, cujo RNA é preferencialmente acumulado em tripomastigotas sangüíneos (Abuin et al., 1999). Estes resultados fortalecem o conceito que os genes TS (GP82, GP90 e Tc85) são constitutivamente transcritos nos diferentes estágios de desenvolvimento do parasita e que o acúmulo de RNAm GP82 e GP90 presentes nas formas metacíclicas é regulado por mecanismos pós-transcricionais. O mesmo foi demonstrado em vários outros genes diferencialmente expressos em T. cruzi (Teixeira, 1998; Di Noia et al., 2000; Avila et al., 2001; Dallagiovanna et al., 2001; Yamada-Ogatta et al., 2004).
A regulação pós-transcricional dos RNAm é particularmente importante em tripanossomas, onde não há evidência de controle da transcrição. Os níveis de RNAm podem ser influenciados por vários fatores: eficiência do processamento do transcrito primário, estabilidade ou a taxa de degradação do RNAm e taxa de iniciação de tradução (Nozaki & Cross, 1995; Furger et al., 1997; Weston et al., 1999; Di Noia et al., 2000; Brittingham et al., 2001; Fluck et al., 2003). A estabilidade do RNAm é regulada pelas variações na meia-vida do transcrito em resposta aos estímulos ambientais como
estresse nutricional e mudanças químicas ou físicas. Analisamos a estabilidade dos RNAm GP82 e GP90, na presença de inibidores de síntese de RNA e proteínas em epimastigotas e tripomastigotas metacíclicos.
Observamos que o tratamento de epimastigotas com o inibidor de transcrição (actinomicina D) reduziu significantemente a meia-vida dos RNAm GP82 e GP90. O decaimento destes RNAs obedecem à cinética bifásica. Metade dos RNAm decaíram em aproximadamente 15 min (GP82) e 2 h (GP90) e a outra metade decaiu em 8 h (GP82) ou mais (GP90) (Fig 4). Este mesmo efeito já foi observado em outros RNAm estágio-específicos de tripanossomatídeos, como prociclina de T. brucei (Hotz et al., 1997). Por outro lado, nenhum efeito aparente foi observado nos RNAm das formas metacíclicas durante o tratamento com a actinomicina D quando comparado com o controle, sendo a meia-vida destes transcritos superiores a 8 h (Fig. 3). Assim, os RNAm GP82 e GP90 são estáveis em tripomastigotas metacíclicos, estágio no qual são preferencialmente acumulados e traduzidos. Estes resultados estão de acordo com aqueles descritos para transcritos abundantes, onde a meia-vida é de várias horas. Em T. brucei, os RNAm prociclina e fosfoglicerato-kinase citosólica (PGKB) em formas procíclicas e VSG de formas sangüíneas apresentam meia-vida superior a 6 h (Furger et al., 1997; Vanhamme et al., 1999; Quijada et al., 2002). Em T. cruzi tem-se observado ainda uma correlação direta entre os níveis de RNAm e a estabilidade dos transcritos (Coughlin et al., 2000; Di Noia et al., 2000). Uma exceção foi encontrada no RNAm β-tubulina, onde a relação foi inversa. O RNAm de 2,3 kb, apesar de ser o mais abundante, é aquele com a menor meia-vida (Bartholomeu et al., 2002).
O uso de inibidores de síntese protéica pode afetar dramaticamente os níveis de transcritos em uma célula. Há dois exemplos de genes de tripanossomatídeos bastante estudados, que têm seus RNAm aumentados em resposta ao tratamento com inibidores de síntese protéica. São eles: a prociclina de T. brucei e a GP63 de L. chagasi (Wilson et al., 1993; Graham & Barry, 1996). O mecanismo responsável por este aumento ainda não é conhecido. Em nosso estudo, a incubação de formas metacíclicas com cicloheximida não afetou visivelmente os RNAm GP82 e GP90, mantendo a meia-vida por mais de 8 h (Fig. 5). Por outro lado, tratamento de epimastigotas com cicloheximida resultou no aumento dos níveis dos RNAm GP82 e GP90 em 2,8 e 2 vezes, respectivamente, após 6 h de tratamento (Fig. 6). Visto que o tamanho dos RNAm correspondeu ao esperado para RNAm maduros, acreditamos que os transcritos acumulados tenham sido processados. Resultados similares foram
obtidos com os transcritos prociclina de T. brucei e tuzina de T. cruzi (Teixeira et al., 1995; Graham & Barry, 1996). Este acúmulo foi mantido durante a primeira hora após a remoção da droga, mas após 4 h, alcançaram os níveis basais de RNAm observados em epimastigotas não tratados (Fig. 7). Um efeito similar foi observado em formas procíclicas de T. brucei, onde o RNAm prociclina não foi afetado pelo tratamento com cicloheximida (Fluck et al., 2003). O acúmulo estágio-específico dos RNAm GP82 e GP90 observados poderia ser explicado pela existência de um mecanismo mediado por proteínas de vida curta que promovem a degradação e remoção dos RNAm GP82 e GP90 em epimastigotas, mas não em tripomastigotas metacíclicos. A recente descrição em T. cruzi de estruturas similares a “P-bodies” (“processing bodies”), onde RNAs não traduzidos são estocados e/ou degradados, e grânulos de estresse, onde os RNAm são protegidos da degradação, sugere que o efeito de inibidores de síntese protéica também pode estar envolvido no rompimento de interações proteína-proteína necessárias para a rápida degradação de RNAm instáveis (Cassola et al., 2007; Holetz et al., 2007).
Duas possíveis explicações para o efeito da cicloheximida em epimastigotas seriam a estimulação da transcrição dos genes GP82 e GP90 ou a mobilização dos RNAm GP82 e GP90 para os polissomos, assim como sugerido para prociclina (Graham & Barry, 1996). A primeira hipótese foi descartada após verificarmos que o tratamento de epimastigotas e tripomastigotas metacíclicos com o inibidor de síntese protéica não teve efeito na transcrição, como mostrado nos experimentos de “run-on” (Fig. 8). Nossos resultados mostram que os transcritos GP82 maduros deixam o núcleo, mas não se associam aos polissomos, em epimastigotas tratados com cicloheximida, descartando também a segunda hipótese (Fig. 11). Estes dados sugerem que o RNAm GP82, apesar de estar presente em grande quantidade, não é traduzido em epimastigotas tratados com cicloheximida.
Análise da distribuição celular dos RNAm GP82 e GP90 mostrou que eles estão presentes principalmente nas frações polissomais de tripomastigotas metacíclicos (fig. 9), corroborando as evidências de que a mobilização de RNAm para polissomos é um importante mecanismo de regulação na expressão gênica estágio-específica em T. cruzi (Avila et al., 2001; Dallagiovanna et al., 2001; Avila et al., 2003; Yamada-Ogatta et al., 2004). Por outro lado, em epimastigotas, onde não há a expressão das proteínas GP82 e GP90, os transcritos não foram detectados nas frações polissomais (Fig. 10). Este resultado poderia ser explicado pela presença de proteínas regulatórias estágio-
específicas que se ligariam nos RNAm GP82 e GP90, impedindo a mobilização aos polissomos e levando rapidamente à degradação em complexos especializados, como os “P-bodies” acima citados. Nas formas metacíclicas, outras proteínas regulatórias estágio-específicas se ligariam nos RNAm GP82 e GP90, levando ao direcionamento aos polissomos e conseqüentemente à tradução.
Os dados de hibridização em “northern blot” foram confirmados por PCR em tempo real, utilizando o gene α-tubulina para normalização dos dados. Embora tenha sido demonstrado que o nível de RNAm α-tubulina é 3 × maior em epimastigotas que tripomastigotas, nós utilizamos este gene para normalização dos resultados pelo fato de o transcrito ser abundante nas duas formas (Bartholomeu et al., 2002). A partir desta observação podemos entender que as diferenças encontradas de 121,1 × e 633,9 × a mais para os transcritos GP82 e GP90 em tripomastigotas metacíclicos, respectivamente, (Fig. 14), foram ainda maiores que as determinadas em nossos experimentos. Estes resultados indicam que o endereçamento dos transcritos GP82 e GP90 para o compartimento polissomal é um mecanismo pós-transcricional, regulado durante o ciclo de vida do T. cruzi.
Para identificar o repertório dos transcritos GP82 presente nos polissomos de epimastigotas e tripomastigotas metacíclicos, fragmentos de aproximadamente 500 pb da fase leitura aberta do gene GP82 foram amplificados pela técnica de RT-PCR, clonados e seqüenciados. O alinhamento da seqüência de aminoácidos codificada pelos transcritos polissomais com aquelas depositadas no banco de dados mostrou eles apresentam maior porcentagem de identidade com a proteína GP82 da cepa CL (AF128843) indicando que esta variante também é transcrita nos parasitas de cepa G (Fig. 15).
As seqüências de aminoácidos codificadas pelos clones de RT-PCR de epimastigotas e tripomastigotas metacíclicos, porém, não apresentaram diferenças significativas na região analisada. O alto grau de conservação entre as seqüências pode ser devido a vários fatores: especificidade dos oligonucleotídeos utilizados, ao fato do transcrito amplificado ser majoritário dentro do repertório de RNAm GP82 ou pelo fato da região analisada ser necessária para manutenção da função biológica da proteína. Dentro da região amplificada encontra-se o domínio de 20 aminoácidos chamado p8, o qual corresponde a um dos sítios de ligação da GP82 à célula hospedeira (Manque et al., 2000). A região p8 em 70 % dos clones seqüenciados
apresenta algum tipo de substituição de aminoácidos sendo elas sinônimas ou não. As substituições encontradas foram: alanina (A) por treonina (T), aspártico (D) por glutâmico (E) e metionina (M) por leucina (L) ou valina (V). Apenas no caso da substituição de alanina por treonina tem-se uma mudança nas propriedades físicas do aminoácido, pois a troca de um aminoácido apolar de cadeia lateral alifática (A) por um aminoácido polar com cadeia lateral não carregada (T). Embora seja necessário o seqüenciamento de uma região maior para avaliar a função biológica, podemos sugerir que as proteínas GP82 codificadas por transcritos polissomais tenham função biológica. Isso porque o domínio p8 destes clones possui alta similaridade com as proteínas GP82 descritas com atividade biológica (Ramirez et al., 1993; Cordero, 2007) e baixa similaridade com o clone CO3 que não é reconhecido pelo anticorpo monoclonal 3F6 e nem inibe a invasão celular pelos tripomastigotas metacíclicos (Atayde et al., 2007).
Têm sido descritos motivos que atuam em cis no RNAm e que são responsáveis pela regulação pós-transcricional que medeia o decaimento do RNAm e afeta a tradução, positiva ou negativamente, dependendo do estágio de desenvolvimento do T. cruzi (Di Noia et al., 2000; D'Orso & Frasch, 2001a). Elementos cis-regulatórios presentes na 3’-UTR dos RNAm de tripanossomatídeos parecem ser responsáveis pela estágio-especificidade nos níveis de RNAm (Furger et al., 1997; Hotz et al., 1997; Coughlin et al., 2000). Diferentes regiões intergênicas e 3’-UTR de RNAm de T. cruzi mostraram ter influência na expressão do gene repórter luciferase (luc) alterando os níveis de RNAm e/ou eficiência da tradução do RNAm repórter (Nozaki & Cross, 1995). Tem sido demonstrado que transcritos de genes de proteínas de superfície de T. cruzi como FL-160 (Weston et al., 1999), amastina (Coughlin et al., 2000), GP72 e GP85 (Nozaki & Cross, 1995) contém seqüências regulatórias que modulam a estabilidade do RNAm. Fatores que atuam em “trans” interagem com estes elementos, determinando a estabilidade ou instabilidade do transcrito (Di Noia et al., 2000; D'Orso & Frasch, 2001a; D'Orso & Frasch, 2001b). Recentemente foram descritas em T. cruzi as proteínas TcUBP1 e TcUBP2 que se ligam ao RNA e estão envolvidas na regulação do RNAm mucina (SMUG). Elas ligam-se aos transcritos SMUG in vivo e regulam seletivamente a estabilidade do transcrito de acordo com o estágio que se encontra o parasita (D'Orso & Frasch, 2001a; D'Orso & Frasch, 2001b).
Como discutido anteriormente, o aumento dos níveis de RNAm GP82 e GP90 em epimastigotas tratados com cicloheximida é devido ao aumento da meia-vida dos
transcritos e não da taxa de transcrição. Para verificar se a seqüência 3’-UTR do RNAm GP82 era responsável pela regulação dos níveis de RNAm nas diferentes formas do parasita, a 3’-UTR do RNAm GP82 foi clonada em fusão com o gene repórter GFP no vetor pTEX (Fig. 16) (Kelly et al., 1992). Apesar desta técnica ser bastante utilizada, devemos ter em mente que a seqüência regulatória em estudo foram removidas do contexto cromossômico a que pertence, devendo os resultados ser interpretados com bastante cuidado.
Análise de tripomastigotas metacíclicos transfectados com os plasmídeos pGFP e pGFP-3’UTR mostrou aumento de 2,5 × no nível de RNAm GFP na população transfectada com o plasmídeo pGFP-3’UTR, quando comparada com a população pGFP (Fig. 18). As diferenças nos níveis de RNAm GFP, observadas nos experimentos de “northern blot”, não são devidas ao número de cópias do plasmídeo nas populações analisadas, uma vez que não foram verificadas diferenças entre as populações (Fig. 17). Hibridização do DNA genômico digerido com a enzima de restrição XhoI com as sondas GFP e Neo confirmou que os plasmídeos estão sendo mantidos como epissomos. Os dados de expressão da proteína GFP obtidos por FACS e “immunoblotting” estão de acordo com os de “northern blot”, uma vez que a população pGFP-3'UTR apresentou níveis de GFP aproximadamente 4 × superior ao encontrado na população pGFP (Fig. 19).
A análise das populações de epimastigotas transfectados com os plasmídeos pGFP e pGFP-3’UTR mostrou que ambas apresentam níveis de RNAm GFP semelhantes na ausência de tratamento com cicloheximida (Fig. 18). Embora não tenha sido o esperado, este efeito pode ser resultado da superprodução destes RNAm, a qual saturaria a maquinaria de regulação da célula (Clayton & Shapira, 2007). Por sua vez, os dados de FACS, confirmados por “immunoblotting”, mostraram que embora haja tradução dos transcritos GFP nas duas populações, a população pGFP apresenta o dobro da concentração de proteína em relação à população pGFP-3’UTR (Fig. 19).
Efeito similar havia sido observado por Nozaki & Cross (Nozaki & Cross, 1995) ao verificar que a 3’-UTR do RNAm GP82 inserida entre o gene luc e a região intergênica do GAPDH provocava diminuição de 3 × na atividade da luc em epimastigotas (Nozaki & Cross, 1995). Quando as populações pGFP e pGFP-3'UTR de epimastigotas foram tratadas com cicloheximida por 6 h, efeito mais acentuado nos níveis de RNAm pôde ser visto. Enquanto que na população pGFP houve uma diminuição de 1,6 × nos níveis
de RNAm GFP, na população pGFP-3’UTR houve um aumento de 1,5 ×. Este comportamento também foi observado com os transcritos GP82, porém em menor intensidade. Não houve alteração nos níveis das proteínas após tratamento com cicloheximida, mostrando que droga inibiu efetivamente a tradução das proteínas e que a vida média da GFP é maior que 6 h (dado não mostrado).
Em conjunto, estes resultados permitem concluir que o aumento do nível da proteína GFP em tripomastigotas metacíclicos é devido ao aumento da concentração do RNAm, confirmando que seqüências presentes na 3’-UTR tem papel na estabilidade do RNAm GP82. Estas seqüências podem estar atuando como elementos regulatórios positivos, estabilizando o RNAm em tripomastigotas metacíclicos. No caso dos epimastigotas, a concentração de proteína GFP não se correlaciona com a quantidade de transcritos, sugerindo que as diferenças ocorram por alterações na tradução, similar ao observado no RNAm prociclina de T. brucei (Furger et al., 1997). As diferenças no efeito da 3’-UTR em epimastigotas e tripomastigotas metacíclicos podem ser devidas à presença de diferentes elementos regulatórios na própria 3’-UTR.
A presença de cis-elementos nos transcritos e de proteínas que se ligam especificamente a estes elementos são os principais responsáveis pela estabilidade ou instabilidade do RNAm na célula. Vários elementos desestabilizadores localizados em regiões codificadoras e não codificadoras já foram descritos em mamíferos. Podemos citar os exemplos: o CRD (“coding region determinant”) do oncogene c-myc, o CDE (“constitutive decay element”) presente na 3’-UTR do fator de necrose tumoral α (TNFα) e o ARE [“adenylate-uridilate (AU)-rich elements”], localizado na 3’-UTR de vários RNAm instáveis (Benjamin et al., 2004). Recentemente foram descritos dois elementos regulatórios na região 3’-UTR do gene mucina de T. cruzi com funções diferentes em epimastigotas e tripomastigotas metacíclicos. O elemento GRE [“guanidilate (G)-rich element”] está envolvido na estabilização do transcrito mucina apenas em epimastigotas e o elemento ARE na degradação do mesmo transcrito em tripomastigotas metacíclicas (D'Orso & Frasch, 2001a).
Estudos prévios em T. cruzi mostraram que a estabilidade do RNAm tem papel importante na regulação gênica. Seqüências ricas em AU similares aos motivos ARE, conhecidos por causar instabilidade em eucariotos superiores, foram identificados nos RNAm mucina (Di Noia et al., 2000). Foram descritos também em T. cruzi fatores protéicos que se ligam a seqüências ricas em AU no RNAm e parecem direcionar estes
transcritos para degradação em epimastigotas (D'Orso & Frasch, 2001a; D'Orso & Frasch, 2001b). De acordo com este achado, analisamos e identificamos elementos ricos em AU nas seqüências 3’-UTR dos RNAm GP82 e GP90. Além disso, foram identificados motivos AUUUA na 3’-UTR destes transcritos. Este pentâmero é encontrado em ARE do tipo I e II, segundo a classificação baseada no número e distribuição do elemento (Chen & Shyu, 1995). O pentâmero é conhecido por ser a menor unidade capaz de conferir instabilidade ao RNAm, quando inserido numa seqüência rica em AU (Zubiaga et al., 1995; Xu et al., 1997).
A comparação das seqüências 3’-UTR dos transcritos GP82 e GP90, as quais apresentam uma identidade de 70 % entre si (Fig. 29), mostrou que elas são ricas em AU. Após seqüenciamento e alinhamento de vários clones de cDNA de GP82 de tripomastigotas metacíclicos (cepa G) e de um contig genômico (cepa CL Brener), ficou evidente que o clone de cDNA L14824 possui a 3’-UTR incompleta (Fig. 20). Como discutido nos resultados, a explicação mais plausível é alinhamento incorreto no momento da síntese do oligo (dT) com uma região interna da 3’-UTR rica em A. Esta região foi encontrada em todos nos clones de cDNA e no contig genômico. Porém, não podemos descartar a hipótese de que, este o clone L14824 corresponda realmente a um RNAm maduro raramente encontrado. De fato, experimentos de “northern blot” mostram que além de uma forte hibridização de um RNA de 2,8 kb (tamanho aproximado do clone EF154827 de 2.909 pb) e sinais mais fracos de tamanhos menores (Fig. 30). Recentemente foi publicado que a 3’-UTR de transcritos TS de tripomastigotas de T. cruzi têm em média um tamanho entre 681 e 735 nt sustentando a hipótese do anelamento interno do oligo (dT) na 3’-UTR do transcrito GP82 (Jager et al., 2007).
As regiões 3’-UTR dos transcritos GP82 e GP90 foram analisadas com o programa mfold (Mathews et al., 1999; Zuker, 2003), o qual prediz a formação de estruturas secundárias do RNA pela minimização da energia. No caso do transcrito GP82, identificamos quatro grampos, enquanto que na GP90 foram detectados três grampos (Figs. 21 e 22, respectivamente). Nestes grampos há a presença de alças de fita simples, as quais parecem ser necessárias para a interação com fatores regulatórios ou endonucleases (Drozdz & Clayton, 1999). Estas regiões poderiam ser responsáveis pela interação com os fatores envolvidos na estabilidade dos transcritos GP82 e GP90.
Devido à heterogeneidade dos elementos AREs envolvidos na desestabilização de transcritos em tripanossomatídeos e a presença de tais elementos na 3’-UTR dos transcritos GP82 e GP90 é necessário investigar a funcionalidade das estruturas secundárias e dos elementos de forma sistemática.
Todavia, para determinar qual(is) elemento(s) estão envolvidos na regulação do gene GP82, são necessárias novas construções contendo deleções de possíveis regiões controladoras. Dados preliminares em nosso laboratório, mostraram que a deleção do pentâmero AUUUA na 3’-UTR do transcrito GP82 (população pGFP-∆AU), diminui em pelo menos 3 × o nível de fluorescência da GFP nesta população, quando comparados com a população controle (pGFP) em tripomastigotas metacíclicos (dados não mostrados).
Recentemente foi comunicado que a deleção apenas do elemento funcional AUUUA em transcritos de T. brucei associados ao gene repórter não tem efeito na estabilidade do mRNA do gene repórter. Para alterar a estabilidade destes transcritos são necessárias deleções maiores em regiões ricas em AU (Isabel Roditi, comunicação pessoal). Com esta informação, novas construções estão sendo preparadas a partir da 3’-UTR do transcrito GP82. A figura 31 apresenta um esquema destas construções, onde a 3’-UTR foi dividida em quatro segmentos de aproximadamente 90 nt cada. O primeiro segmento após o códon de terminação não possui nenhum elemento regulatório conhecido, enquanto que o segmento 3 é onde se concentra a região rica em AU. Os segmentos 2 e 4 contêm o elemento GRE e o pentâmero AUUUA, respectivamente. As estruturas secundárias das 3’-UTR contendo as deleções foram preditas para determinar possíveis alterações. Foi observado que estas novas estruturas se tornaram menos estáveis quando comparadas a 3’-UTR completa (Fig. 21).
Resumindo, os efeitos regulatórios da 3’-UTR dos transcritos GP82 e GP90 são bastante complexos. Nossos dados são consistentes com o modelo no qual a 3’-UTR contém elementos regulatórios positivos e negativos que atuam de maneira estágio- específica.
Estudos para melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na estabilidade dos RNAm GP82 e GP90 estão em progresso em nosso laboratório. Uma vez que os