4.6.1 Atividade Inibitória da Eclosão dos Ovos de Aedes aegypti
O ensaio de atividade inibitória da eclosão dos ovos de Aedes aegypti por PmFP, em diferentes concentrações, foi realizado de acordo com a metodologia descrita por Ramos et al. (2006), com algumas modificações. Os testes foram realizados em triplicata e sob condições ideais de temperatura (27 ± 2 °C) e umidade (80% ± 10), com fotoperíodo de 12h claro/12 h escuro. Tiras de papel contendo 20 ovos, contados em um estereomicroscópio (Tecnival), foram mergulhadas em 5 mL de cada amostra (PmFP 1; 0,5; 0,250; 0,225; 0,200 e 0,175 mgP/ml e os controles negativo albumina sérica bovina (BSA) (1 mgP/ml) e água destilada), todas contendo 1% de álcool etílico absoluto, dispostas em tubos de ensaio. Após, 72 h, à temperatura ambiente, foi contado o número de larvas vivas ou mortas em cada amostra e, a partir disso, foi calculado o número de ovos não-eclodidos, o percentual de inibição da eclosão dos ovos e, por fim, foram retirados os ovos não eclodidos para observações de possíveis alterações no estereomicroscópio.
A CI50, ou seja, a concentração capaz de inibir 50% de eclosão, foi calculada através
4.6.2 Atividade Larvicida contra Aedes aegypti
O ensaio de avaliação da atividade larvicida contra A. aegypti pelos EBs das sementes das 10 espécies, foi realizado de acordo com a metodologia de WHO (2005), com algumas modificações. Vinte larvas em 3º estádio larval foram coletadas com pipetas Pasteur, colocadas em papel filtro para remover o excesso de água e então transferidas com um pincel para copos plásticos descartáveis de 150 ml contendo, em cada um, 100 mL de EB de cada semente. A mortalidade e a sobrevivência foram monitoradas durante as primeiras três horas do experimento e registradas após 24 horas de exposição à temperatura ambiente (25 C). As larvas foram consideradas mortas quanto nenhum movimento foi detectado após serem tocadas com uma escova fina. Foi contado o número de larvas vivas ou mortas em cada amostra e, a partir disso, foi calculado o percentual de mortalidade. O experimento foi realizado em triplicata, para cada extrato, em três análises diferentes e água destilada foi usada como controle negativo.
4.6.3 Análise de larvas tratadas
As larvas de 1º estádio que se encontravam vivas após o teste de inibição de eclosão de ovos com o tratamento de PmFP (0,225 mgP/ml) foram coletadas com pipetas Pasteur, colocadas em papel filtro para remover o excesso de água e então transferidas com um pincel para tubos de ensaio contendo água destilada e submetidas à temperatura de -20°C por aproximadamente 5 min, a fim de deixá-las letárgicas. Após esse tempo, foram depositadas em tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,2 com paraformaldeído 4% para fixação (a 4ºC). Após duas horas de fixação, as larvas foram retiradas e colocadas sobre lâminas, onde o excesso de tampão de fixação foi retirado e foi acrescentada uma gota de glicerol. Lamínulas foram colocadas cuidadosamente sobre as larvas, e a amostra foi observada em estereomicroscópio.
4.6.4 Atividade Inibitória do Crescimento de Fungos Filamentosos em Meio Sólido
O ensaio de inibição do crescimento de fungos filamentosos fitopatogênicos pelos EBs das sementes das 10 espécies em meio sólido foi realizado seguindo a metodologia descrita por Roberts e Selitrennikoff (1990), com algumas modificações. Foram utilizados os seguinte fungos filamentosos: Aspergillus niger, Colletotrichum musae, C. truncatum, Fusarium oxysporum, F. solani, Mucor sp., Neurospora sp., Penicillium herguei, Pithium oligandrum, Phomopsis sp. Rhizoctonia solani e Trichoderma viridae. As culturas de fungos foram inoculadas como “pellets” de 8 mm no centro de placas de ágar batata. As placas foram incubadas em temperatura ambiente por 48 h ou mais, dependendo da velocidade de crescimento de cada fungo. Discos de papel de filtro com 3 cm de diâmetro foram colcados aproximadamente 5 mm da borda da placa de Petri. Foram injetados nos discos 300 µL de EB de cada semente (esterilizados em filtro Millipore® de 0,22 m de poro) e os controles BSA (10 mg. mL-1), tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH7,0 (controle negativo), NaCl 0,9% (controle negativo) e nistatina 100.000 UI.mL-1 (EMS, Hortolândia, São Paulo) (controle positivo). As placas foram novamente incubadas à temperatura ambiente até o crescimento restante dos fungos em presença das amostras. A formação de halos ao redor dos poços indicou inibição do crescimento fúngico.
4.6.5 Atividade Inibitória do Crescimento de Fungos Filamentosos em Meio Líquido
O ensaio de inibição do crescimento de fungos filamentosos fitopatogênicos por PmFP em meio líquido foi realizado seguindo a metodologia descrita por Freire et al. (2002), com algumas modificações. Para o ensaio foram utilizados os seguintes fungos fitopatogênicos: Aspergillus niger, Fusarium solani, Penicillium herguei e Rhizoctonia solani. Inicialmente, os fungos filamentosos foram repicados da micoteca para placas estéreis de agar batata e incubadas a 37 ºC, por uma semana, sendo, então, utilizados no experimento, após a obtenção da suspensão de esporos. Placas de microtitulação de poliestireno (estéreis), contendo 96 poços, foram postas em câmara de fluxo laminar e a cada poço adicionados 100 L de meio YPD (“Yeast Peptone Dextrose”, Difco Co., EEUU) estéril, seguidos de 10 L da suspensão
Millipore® de 0,22 m de poro), PmFP (500; 250; 125; 62,5 e 31,25 µg/ml) e dos controles negativos ovoalbumina (500 µg/ml), tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2 (controle negativo) e peróxido de hidrogênio 0,1 M (controle positivo). Em seguida, as placas de microtitulação foram submetidas a uma leitura inicial de absorbância a 630 nm em leitor de microplacas, seguidas de novas leituras a cada 12 h, até um total de 72 h. Entre os intervalos de tempo, as placas foram incubadas em estufa a 37 °C.
4.6.6 Atividade Inibitória do Crescimento de Leveduras em Meio Líquido
O ensaio de inibição do crescimento das leveduras Candida albicans, C. tropicalis Saccharomyces cerevisiae, e Pichia anomala por PmFP, foi realizado de acordo com a metodologia descrita por Ribeiro et al. (2007), com algumas modificações. Inicialmente, as leveduras foram repicadas para placas estéreis de agar saboraud e incubadas a 37 ºC, por 24 - 48 h, sendo, então, utilizadas no experimento. Nas placas de microtitulação de poliestireno (estéreis), contendo 96 poços, foram adicionados, em cada poço, 100 L de caldo BHI (Brain and Hearth Infusion, Difco Co., EEUU), com pH ajustado para 5,0, contendo uma concentração de células leveduriformes correspondente a uma leitura de absorbância de 0,05, comprimento de onda de 600 nm, seguidos seguidos de 100 L de cada amostra estéril (esterilização em filtro Millipore® de 0,22 m de poro), PmFP (500; 250; 125; 62,5; 31,25 e 15,62 µg/ml) e os controles: ovoalbumina (500 µg/ml) como controle negativo, e o formol (0,04%), como controle positivo. Em seguida, as placas de microtitulação foram submetidas a uma leitura inicial de absorbância a 600 nm em uma leitora de microplacas, seguidas de novas leituras a cada 6 h, até um total de 48 h. Entre os intervalos de tempo, as placas foram incubadas em estufa a 37 °C.
4.6.7 Atividade Inibitória do Crescimento Bacteriano em Meio sólido
A atividade antibacteriana foi determinada pelo método de difusão em meio sólido, segundo a metodologia de Soares et al. (2007), na qual as bactérias Bacillus subtilis ATCC
6633, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterobacter aerogens ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Pseudomonas aeruginosa ATCC 25619 e Salmonella choleraesuis ATCC 10708 foram cultivadas em caldo nutritivo (BHI – “Brain Heart Infusion” – DIFCO®) e incubado a 37°C por 24 horas em microaerofilia através do método da chama da vela. Após a observação da turvação do meio, procedeu-se a semeadura da bactéria em placa de Petri contendo o meio de cultura Ágar Müller Hinton (DIFCO®) pela técnica de inundação. Foram realizadas perfurações no meio de cultura de 6 mm de diâmetro. Nos orifícios foram inseridos 50 ml de amostra [EB de cada semente (esterilização em filtro Millipore® de 0,22 m de poro) e os controles BSA (10 mg/mL), tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH7,0 (controle negativo) e solução de clorexidina a 0,12% (controle positivo)]. As placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37°C por um período de 24 horas. Com o objetivo de controlar o estudo e assegurar a sua reprodutibilidade, os experimentos foram realizados em triplicata. Foi considerado positivo quando a amostra era capaz de produzir halos de inibição em torno da amostra analisada.
4.6.8 Atividade Inibitória do Crescimento Bacteriano em Meio Líquido
O ensaio de atividade inibitória do crescimento bacteriano em meio líquido de PmFP foi realizado de acordo com o protocolo descrito por Hissa et al. (2008). Foram utilizadas as bactérias Gram-positivas Bacillus subtilis ATCC 6633 e Staphylococcus aureus ATCC 25923, e as Gram-negativas Enterobacter aerogens ATCC 13048 e Salmonella choleraesuis ATCC 10708. Inicialmente, as bactérias foram repicadas da bacterioteca para placas estéreis de agar nutritivo e incubadas a 37 ºC, por 24 h, sendo, então, utilizadas no experimento. O ensaio foi realizado em meio líquido da seguinte forma: placas de microtitulação de poliestireno (estéreis), contendo 96 poços, foram postas em câmara de fluxo laminar e a cada poço adicionados 100 L de caldo nutritivo contendo células bacterianas numa concentração de 107 UFC. mL-1 (absorbância entre 0,1 e 0,2, a 600 nm), seguidos de 100 L de cada amostra estéril (esterilização em filtro Millipore® de 0,22 m de poro), PmFP (500; 250; 125; 62,5 e 31,25 µg/ml), de Ovoalbumina (500 µg/ml), como controle negativo e de Formol 0,4%, como controle positivo. Em seguida, as placas de microtitulação foram submetidas a uma leitura inicial de absorbância a 600 nm em uma leitora de microplacas, seguidas de novas
leituras a cada 4 h, até um total de 24 h. Entre os intervalos de tempo, as placas foram incubadas em estufa a 37 °C.