A atividade inibitória sobre a tripsina de PmFP foi determinada de acordo com Erlanger et al. (1961). Vinte microlitros (20 µl) de solução de tripsina bovina (0,3 mg/mL em HCl 0,0025 M) foram pré-incubados, por 15 min a 37 °C, com tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 e 0,1 mL da solução teste. Após esse período, a reação foi iniciada adicionando-se 0,2 mL de azocaseína 1% em tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5. Decorridos 30 min, a reação foi interrompida adicionando-se 0,3 mL de solução de TCA 20%. A mistura de reação foi centrifugada a 10.000 x g, por 10 min e o sobrenadante alcalinizado com NaOH 2 N na proporção 1:2 (v/v), a fim de intensificar a cor do produto da clivagem da azocaseína pela enzima. A leitura das absorbâncias foi realizada a 440 nm. Provas em branco foram realizadas em duplicata e os testes em triplicata. Os resultados foram expressos em Percentual de Inibição (%) e Unidade de Inibição (UI), definida como o decréscimo em 0,01 da absorbância a 440 nm.
4.5.3 Inibidores de Quimotripsina
A atividade inibitória sobre a quimotripsina de PmFP foi determinada de acordo com Erlanger et al. (1961). Vinte microlitros de solução (20 µl) de quimotripsina bovina (0,1 mg/mL em tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 contendo CaCl 0,02 M) foram pré-incubados, por 15 min a 37 °C, com o mesmo tampão e 0,1 mL da solução de PmFP. Após esse período, a reação foi iniciada adicionando-se 0,2 mL de azocaseína 1% em tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5. Decorridos 30 min, a reação foi interrompida adicionando-se 0,3 mL de solução de TCA 20%. A mistura de reação foi centrifugada a 10.000 x g, por 10 min e o sobrenadante alcalinizado com NaOH 2 N na proporção 1:2 (v/v), a fim de intensificar a cor do produto da clivagem da azocaseína pela enzima. A leitura das absorbâncias foi realizada a 440 nm. Provas em branco foram realizadas em duplicata e os testes em triplicata. Os resultados foram expressos em Percentual de Inibição (%) e Unidade de Inibição (UI), definida como o decréscimo em 0,01 da absorbância a 440 nm.
4.5.4 Ureases
A determinação da atividade ureásica foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Kaplan (1969), com algumas modificações (VASCONCELOS et al., 1997). Uma alíquota de 0,1 mL de uma solução de uréia 500 mM foi misturada com 0,7 mL de EDTA 2%, tamponando com uma solução de fosfato de sódio 0,02 M, pH 6,5. Em seguida, 0,2 mL dos EBs das farinhas das 10 sementes foram adicionadas e as misturas foram incubadas a 37 ºC, por 15 min. Posteriormente, foram adicionados às misturas 1,0 mL da solução A (62 g de fenol + 0,25 g de nitroprussiato de sódio/L) e 1,0 mL da solução B (43 mL de hipoclorito de sódio + 20 g de hidróxido de sódio/L), sendo deixadas a 37 ºC, por 5 min. Após esse tempo, foram adicionados 7,0 mL de água deionizada aos tubos, sendo estes cobertos com filme de PVC e agitados vigorosamente. As leituras das absorbâncias foram feitas a 625 nm e a atividade enzimática foi avaliada em relação a uma curva padrão obtida com urease (EC 3.5.1.5, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, EEUU). A atividade ureásica foi expressa como unidades de enzima por Kg de farinha (U/KgF).
4.5.5 Quitinases
As atividades quitinolíticas foram determinadas segundo o método colorimétrico descrito por Boller (1993), usando como parâmetro a liberação de N-acetil-D-glucosamina (NAG) a partir da ação hidrolítica das enzimas sobre a quitina coloidal Boller (1992). Inicialmente, a atividade quitinolítica total foi determinada por incubação de 250 µL da amostra (EBs das sementes das 10 espécies, frações cromatográficas e PmFP) com 250 µL da quitina coloidal (10 mg/ml), a 37 °C, durante 1 h, em seguida, fervidos em banho-maria a 98 °C por 5 minutos. Os tubos, após resfriamento, foram centrifugados a 10.000 x g, 25 °C, por 10 minutos, e alíquotas de 300 µL foram retiradas e incubadas com 10 µL da solução de glucoronidase (EC 3.2.1.31), a 37 °C, por 1 h. A solução de glucoronidase usada nos ensaios foi preparada por diálise da preparação bruta de Helix pomatia (Tipe HP-2, 132.000 Unidades/ml) com tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2, e diluição (10 vezes) com o mesmo tampão de reação. Esta segunda etapa enzimática também foi interrompida por meio de fervura em banho-maria, durante 10 minutos. Para determinação da quantidade de NAG liberada a partir da quitina coloidal sob ação de enzimas quitinolíticas, 310 l do hidrolizado foram acrescidos de 190 l de tampão acetato de sódio 50 mM, pH 6,0 e 100 l de tetraborato de sódio e potássio 0,6 M. A mistura reacional foi aquecida em banho-maria a 98 ºC, por 5 minutos. Após resfriamento, 1 ml da solução de -dimetilaminobenzaldeido (DMAB), foi adicionado à mistura reacional e incubado em banho-maria a 37 ºC por 20 minutos. A solução de DMAB foi preparada dissolvendo-se 10,0 g de DMAB em 100 mL de ácido acético glacial contendo 12,5% (v/v) de ácido clorídrico 11,5 M. As leituras de absorbância foram feitas no comprimento de onda de 585 nm. Para cálculo da quantidade de açúcar liberado na reação, uma curva padrão construída com concentrações variadas (100 a 500 µM) de N-acetil-D- glucosamina foi utilizada (REISSIG; SROMENGER; LELOIR, 1955). A atividade quitinolítica foi expressa em nanokatal (nKat) por mg de proteína (nKat/mgP), onde 1 nKat equivale a 1 nmol de N-acetil-D-glucosamina liberado por segundo.
4.5.6 -1,3-glucanases
A atividade de -1,3-glucanase foi avaliada de acordo com o método descrito por Boller (1993), pelo qual se detecta a glucose liberada no meio reacional como conseqüência da hidrólise da laminarina, usada como substrato. A solução de laminarina (2 mg/mL), diluída em tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2, foi aquecida a 60 °C, por 10 minutos, e exaustivamente dialisada contra o mesmo tampão para remoção de glucose livre. Alíquotas de 100 µL da amostra (EBs das sementes das 10 espécies, frações cromatográficas e PmFP) foram incubadas com 900 µL da solução de laminarina, a 50 °C, por 30 minutos. Em seguida, foi adicionado 1 mL da solução “D” (1 mL da solução “B” + 25 mL da solução “A”) e a mistura incubada a 100 °C, por 20 minutos. A solução “A” continha 25 g de carbonato de sódio + 25 g de tartarato de sódio e potássio + 20 g de bicarbonato de sódio + 200 g de sulfato de sódio anidro + H2O grau Milli-Q q.s.p. 1000 mL. A solução “B” continha 15 g de sulfato de cobre pentahidratado + 20 µL de ácido sulfúrico concentrado + H2O grau Milli-Q, q.s.p. 100 mL. Após resfriamento dos tubos, foi adicionado 1 mL da solução “C” (3 g de arseniato de sódio heptahidratado + H2O grau Milli-Q q.s.p. 25 mL), e estes agitados até a completa remoção de gases sendo, então, deixados em repouso por 5 minutos. As leituras de absorbância foram feitas a 520 nm. Para cálculo da quantidade de açúcar liberado na reação foi utilizada uma curva padrão construída a partir de concentrações variadas de glucose (7,5 a 240 µg/mL), preparadas em tampão acetato de sódio 0,05 M, p H 5,2. A atividade de -1,3- glucanase foi expressa em nKat/mgP, onde 1 nKat equivale a 1 nmol de glucose liberado por segundo.
4.5.7 Atividade proteolítica