6.6.1.1 – Espaço e responsáveis para o desenvolvimento de estudo
O estudo antifúngico foi desenvolvido no Laboratório de Micologia do Departamento de Ciências Farmacêuticas localizado no Centro de Ciências da Saúde/Universidade Federal da Paraíba. Os responsáveis para o desenvolvimento desse trabalho foram os alunos de pós-graduação Ana Luiza A. L. Perez e Cássio Ilan S. Medeiros com a supervisão da Profa. Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima no período de novembro de 2014 a abril de 2015.
6.6.1.2 - Produtos testados
Nos ensaios de atividades biológicos foram utilizadas na primeira etapa vinte e duas amidas codificadas de NR1 até NR22. Logo depois, em uma segunda etapa, foram disponibilizados 10 compostos éteres e ésteres derivados da amida do ácido vanílico (AR1-AR4; AC-1; AK1-AK6). As substâncias foram usadas nos ensaios na concentração 1024 até 64 µg/mL. Foram solubilizadas em dimetilsulfóxido- DMSO (MERK), numa proporção até 2%, para não ocorrer interferência sobre a biologia do micro-organismo. Foi adicionado 10 µL de Tween 80 % e, em seguida, água destilada esterilizada na quantidade suficiente para dois (02) mL (CLELAND; SQUIRES, 1991). 6.6.1.3 -Meios de cultura usados nos ensaios
Para o controle de atividade antifúngica foram utilizados caldo Sabouraud dextrose como o controle do meio (isento de leveduras), controle de crescimento do micro-organismo (leveduras) e nistatina (100 UI), adquirida comercialmente da SIGMA-ALDRICH®.
6.6.1.4 - Controle do ensaio antifúngico
Para os controles dos ensaios de atividade antifúngica foram utilizados caldo Sabouraud dextrose (meio isento de produto e de leveduras), controle de crescimento do micro-organismo (leveduras) e nistatina (100 UI/mL), adquirida comercialmente da SIGMA-ALDRICH®.
95 6.6.1.5 - Leveduras do gênero Candida
Nos ensaios para avaliação da atividade biológica do produto, foram incluídas 5 cepas de Candida albicans: ATCC 76.645, C. albicans LM-36; C. albicans LM-P20,
C. topicalis ATCC-13803, C. tropicalis LM-36, C.krusei LM-13 e C. krusei LM-656. As cepas foram adquiridas no Instituto Adolfo Lutz de São Paulo, Laboratório de Micologia e de Microbiologia do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal da Paraíba. As mesmas foram mantidas em meio de cultura apropriado, agar Sabouraud Dextrose- ASD (DIFCO LABORATORIES/France/USA) e conservadas a 4 ºC (geladeira); e a 35 ºC (leveduras).
A suspensão dos micro-organismos foi preparada conforme o tubo 0,5 da Escala McFarland, ajustada através de leitura espectrofotométrica (Leitz-Photometer 340-800), para 90% T (530 nm), correspondendo, aproximadamente, a 106 UFC/mL (NCCLS 2008; HADACEK & GREGER, 2000; CLELAND; SQUIRES, 1991).
6.6.1.6 - Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
A determinação da CIM dos produtos testados foi realizada pela técnica de microdiluição, utilizando placas de microdiluição contendo 96 cavidades com fundo em forma de “U” e em duplicata. Em cada orifício da placa, foi adicionado 100 µL do meio líquido duplamente concentrado. Em seguida, 100 µL de cada produto solubilizado, também duplamente concentrado, foram dispensados nas cavidades da primeira linha da placa. E por meio de uma diluição seriada a uma razão de dois, foram obtidas concentrações de 1024 µg/mL até 64 µg/mL, de modo que na primeira linha da placa se encontrará a maior concentração e na última, a menor concentração. Por fim, foram adicionados 10 µL do inóculo dos micro-organismos nas cavidades, onde cada coluna da placa referiu-se, especificamente, a uma cepa (ESPINEL-INGROFF et al., 2002).
Foi feito o controle de crescimento do micro-organismo no meio de cultura; e do antifúngico fluconazol (100 µg/mL) como medida comparativa com os obtidos pelas substâncias testadas. As placas foram seladas e incubadas a 35°C / 24-72 h (Leveduras). E foi considerada como CIM, a menor concentração do produto capaz de inibir visualmente o crescimento microbiano verificado nas cavidades, quando comparado com o crescimento controle.
96 A determinação da Concentração Fungicida Mínima- CFM das substâncias foi realizada após leitura da CIM. Foram retiradas alíquotas de 10 L do sobrenadante das cavidades, onde foi observada completa inibição do crescimento fúngico e semeadas em placas contendo 20 mL ágar Sabouraud dextrose. Incubação: 35° C por 24-48 horas. Após a realização da leitura, a CFM foi considerada como a menor concentração na qual ocorreu o crescimento inferior a três (3) colônias/ aproximadamente 99 a 99,5 % de atividade de morte (ESPINEL-INGROFF et al., 2002).
Os ensaios foram realizados em duplicata e o resultado expresso pela média geométrica dos valores de CIM e CFM obtidas nos dois ensaios (CLEELAND; SQUIRES, 1991; ELOFF, 1998; SOUZA et al., 2007).
A atividade antimicrobiana dos produtos foi interpretada e considerada ativa ou não, conforme os seguintes critérios: 50-500 µg/mL= forte/ótima atividade; 600-1500 µg/mL= moderada atividade; >acima de 1500 µg/mL= fraca atividade ou produto inativo (SARTORATTO et al., 2004; HOUGHTON et al.; 2005).
6.6.2. Estudo de atividade antifúngica II
6.6.2.1. Espaço e responsáveis para o desenvolvimento de estudo
O estudo antifúngico foi desenvolvido na Instituição: Laboratório de Bioprospecção e Experimentação em Leveduras (LABEL) da Universidade Federal do Ceará pelos pesquisadores: Prof. Dr. Hélio Vitoriano Nobre Júnior, Ma. Cecília Rocha da Silva e João Batista de Andrade Neto em fevereiro de 2015.
6.6.2.2. Produtos testados
Nos ensaios de atividades biológicos foram utilizadas vinte e duas amidas codificadas de NR1 até NR22 e 10 compostos éteres e ésteres derivados da amida do ácido vanílico (AR1-AR4; AC-1; AK1-AK6), resultando no total de 32 compostos. Os compostos mencionados acima foram solubilizados em dimetilsulfóxido - DMSO (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA) numa proporção até 2% para não ocorrer interferência sobre a biologia do micro-organismo.
6.6.2.3 - Controle do ensaio antifúngico
Para o controle de atividade antifúngica foi utilizado apenas o meio de cultura e o inóculo padronizado.
97 6.6.2.4 - Microrganismos do gênero Candida usado
Foram utilizadas 2 cepas de coleção: Candida parapsilosis (ATCC® 2201λ™)
e Candida krusei(ATCC® 14243™) pertencentes ao LABEL.
6.6.2.5- Meios de cultura usados nos ensaios
Os meios de culturas utilizados nos ensaios de atividade antifúngica foram ágar Sabouraud dextrose preparada a partir de uma suspensão de inóculo inicial de acordo com a escala 0,5 McFarland. Os meios foram preparados conforme as instruções do fabricante.
6.6.2.6 - Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)
Foi utilizado a técnica de microdiluição em caldo de acordo com o documento M27-A3 (CLSI, 2008), utilizando o meio de cultura RPMI 1640 (pH 7,0 ± 0,1) tamponado com 0,165 M do ácido morfolinopropanosulfônico (MOPS) (Sigma, EUA). As substâncias foram testadas no intervalo de concentração de 500 - 0,97 µg/ mL. As placas foram preparadas no dia da realização do teste para evitar que a mesma fosse congelada.
A partir de um cultivo de 24h das leveduras a serem testadas, realizado em ágar Sabouraud dextrose foi preparada uma suspensão de inóculo inicial de acordo com a escala 0,5 McFarland. Em seguida, foram realizadas diluições seriadas em meio RPMI 1640 para obtenção de inóculo final contendo 0,5 a 2,5 x 10³ UFC/mL. As microplacas foram incubadas por um período de 24 horas a uma temperatura de 35ºC (± 2ºC). As leituras visuais foram realizadas após esse período.
A concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada como a menor concentração da droga capaz de inibir 90% do crescimento do micro-organismo, em comparação com o verificado no poço controle contendo somente o meio de cultura e o inóculo padronizado (CLSI, 2012).
6.6.3. Estudo de Atividade antibacteriana das amidas cloradas e derivados éteres e