ácidos cinâmicos e benzoicos com as 4-halobenzilamina, as amidas foram testadas em dois tipos de atividade antifúngica. A primeira foi a técnica de microdiluição em caldo de acordo com o protocolo de SARTORATTO et al., 2004; ELOFF et al., 1978 e HOUGHTON et al., 2005, utilizando 7 cepas de Candida albicans: C. albicans ATCC
65 76645, C. albicans LM-106; C. albicans LM-23, C. tropicalis ATCC-13803, C. tropicalis LM-36, C. krusei LM-13 e C. krusei LM-656. A outra metodologia foi técnica de microdiluição em caldo de acordo com o documento M27-A3 (CLSI, 2008), utilizando 2 cepas de coleção: Candida parapsilosis (ATCC® 2201λ™) e Candida krusei (ATCC® 14243™) que estão descritos na Seção 4.6.3. A atividade antifúngica (Tabela 9) dos produtos foi interpretada e considerada ativa ou não de acordo com os seguintes parâmetros: 50-100 g/mL = boa atividade; 100-500 g/mL = atividade moderada; 500-1000 = fraca atividade; > 1000 g/mL = produto inativo (HOLETZ et al., 2002).
O estudo de relação estrutura-atividade entre a amida cinâmica, a amida benzoica e seus análogos químicos foi baseado nos resultados da atividade inibitória sobre as cepas fúngicas do gênero Candida testadas. Esse procedimento é relevante devido ao fato desses compostos serem estruturalmente semelhantes, havendo mudança no número e no tipo de substituintes no anel aromático que podem causar alterações significativas nas propriedades dos compostos. Logo os resultados obtidos neste trabalho podem servir de referência para o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos com perfil biológico mais acentuado.
Os resultados dos ensaios de atividade antifúngica das amidas NR1 a NR22, de acordo com o protocolo de SARTORATTO et al., 2004 e HOUGHTON et al.; 2005, desenvolvido no laboratório de microbiologia, coordenado pela profa. Dra. Edeltrudes, estão registrados na Tabela 18 (pag 70). As espécies de leveduras apresentaram sensibilidade às amidas NR1, NR2, NR3, NR5, NR6, NR7, NR10, NR14, NR15, NR21. As demais substâncias não produziram inibição sobre o crescimento das cepas.
Considerando NR1 como esqueleto base de estudo por sua estrutura simples em relação às outras amidas e que obteve uma CIM de 512 µg/mL sobre duas cepas (29 % das cepas testadas) e 1024 µg/mL sobre 4 cepas (57% das cepas testadas), observa-se que seus análogos orto e meta-hidroxilados NR5 e NR6 obtiveram um aumento na inibição fúngica, obtendo CIM de 256 sobre três das sete cepas (43 % das cepas testadas), 512 µg/mL sobre duas cepas (29 % das cepas testadas) e 1024 µg/mL sobre o restante das cepas testadas, havendo um aumento no espectro de ação para 100% testadas com CIM’s menores em algumas delas. Contudo, o análogo para-hidroxilado NR7 obteve uma inibição inferior à amida cinâmica, sugerindo que a hidroxila no anel age potencializando a inibição do núcleo básico da estrutura nas posições orto e meta e
66 diminuindo esse efeito na posição para em relação à amida do ácido cinâmico. As amidas do ácido cafeico e férulico obtiveram resultados moderados, inibindo 100% das cepas. O NR2 obteve CIM’s de 256 sobre três cepas de Candida albicans (43 % das cepas testadas), 512 µg/mL sobre três cepas de Candida tropicalis e Candida krusei (43 % das cepas testadas) e 1024 µg/mL sobre o restante das cepas testadas. Ao analisar as estruturas dos compostos NR2 e NR3, percebe-se que dissubstituição nas posições 3 e 4 com hidroxilas e metoxilas contribuiem para o aumento da atividade antifúngica. A amida do ácido 2-trans-nitrocinâmco (NR10) obteve o melhor efeito inibitório dentre as amidas cinâmicas, sugerindo que um grupo nitro causa uma inibição considerável sobre os fungos do gênero Candida. A literatura relata que o ácido cinâmico possui atividade de 110 µg/mL sobre algumas espécies de cepas de Candida albicans
(SCHMIDT et al., 2010) e inativo sobre outras espécies desse gênero (GEORGIEV et al., 2012). De maneira geral, ao se comparar a amida NR1 ao seu ácido de origem, observa-se que anel aromático clorado da amida como foi feito nas reações, causa uma ampliação no espectro de ação fungistático dos derivados nitrogenados. A mesma observação pode ser feita sobre NR7 cujo ácido de origem, o ácido p-cumárico, não tem atividade alguma sobre as cepas de Candida (GUZMAN, 2014a). Ao comparar a atividade sobre cepas do gênero Candida, a amida cafeica (NR2) obteve uma maior CIM do que seu ácido de origem (123 µg/mL), porém uma atividade igual e maior, respectivamente, do que a cafeoilfeniletalamina (250 µg/mL) e cafeoiltriptamina (500 µg/mL) (GEORGIEV et al., 2012; GUZMAN, 2014a). A amida ferúlica (NR3) tem uma CIM maior do que o ácido ferúlico (199 µg/mL sobre espécies de C. albicans C. krusei) e uma CIM menor, do que os análogos ésteres estudados como é o caso do ferulato de metila, etila , butila de CIM iguais a 1212 µg/mL como também é menos sensível do que amidas análogas a exemplo feruloil tiramina (123 µg/mL) e feruloil triptamina (123 µg/mL) (GEORGIEV et al., 2012; NAKAUCHI et al., 2002). Diante do que foi exposto a anel aromático para-clorado tem um papel fundamental na atividade antifúngica das amidas em estudo, já que é observado uma ação fugistática em várias espécies do gênero Candida em comparação a trabalhos de revisão (GUZMAN, 2014a).
Entretanto, alguns substituintes no anel aromático cinâmico, como metoxila (NR4) e cloro (NR8) na posição para, não afetam o crescimento fúngico sobre as cepas testadas. Também se observou que trissubstituições como um anel 3,4,5-trimetoxilado (NR11) ou 3,5-dimetoxilado-4-hidroxilado (NR9) não interferem no crescimento dessas
67 leveduras, apesar da literatura demonstrar que amidas sinápicas terem atividade antifúngica (GUZMAN, 2014a).
Ao analisar o grupo de amidas benzoicas, observa-se que a grande maioria das amidas desse grupo não obteve a atividade antifúngica sobre as cepas testadas. Um exemplo notório é a amida do ácido benzoico, quando se compara com a amida do ácido cinâmico, não obteve sequer uma atividade sobre as cepas testadas. A incapacidade da NR12 de inibição sobre as cepas fúngicas pode estar relacionada com ausência do espaçador (CH2=CH2) entre o anel aromático e a carbonila da amida.
Quimicamente, a dupla ligação no esqueleto das amidas cinâmicas pode ter o papel de um agente espaçador que contribui para a atividade antifúngica, como também pode estar aumentando a conjugação eletrônica. No caso das amidas benzoicas sua estrutura terá uma conjugação menor, diminuindo drasticamente a sua sensibilidade aos fungos testados.
As amidas benzoicas que tiveram atividade biológica foram aquelas sintetizadas a partir ácido 4-hidroxibenzóico, do ácido gálico e do ácido vanílico. A amida do ácido 4-hidroxibenzoico (NR17) obteve uma CIM de 256 µg/mL sobre a cepa de Candida krusei LM-656 e 1024 µg/mL sobre a cepa de Candida tropicalis LM-36, ou seja, inibindo apenas 29% das cepas testadas. Essa amida tem uma atividade fraca, enquanto as amidas do ácido gálico (NR14) e do ácido vanílico (NR15) mostraram atividades consideráveis de acordo com suas CIM’s.
Algumas amidas benzoicas mostraram maiores sensibilidades consideráveis. Isso pode ser observado de acordo com os resultados de duas amidas benzoicas: a amida NR14 e principalmente a amida NR15 que obtiveram uma atividade antifúngica alta. A NR14 inibiu 57% das cepas de espécies de Candida (quatro das sete cepas) com CIM de 256 µg/mL e 43% das outras cepas (três das sete espécies testadas) com CIM de 512 µg/mL. A NR15 inibiu 86 % das cepas de Candida, seis das sete cepas desse gênero) com CIM de 256 µg/mL e a cepa testada de Candida albicans ATCC-76645 com CIM de 512 µg/mL. Esses resultados mostram que mesmo com ausência do espaçador (dupla ligação), as amidas benzoicas 3,4,5-triidroxiladas ou amidas 3-metoxi-4-hidroxiladas demonstram inibição sobre os fungos com alta sensibilidade. A amida vanílica se destacou como melhor antifúngico dentre as amidas em estudo. Mesmo tendo uma CIM menor do que seu ácido de origem (o ácido vanílico), que tem uma CIM de 50 µg/mL sobre cepas do gênero Candida (REN et al., 2009), a amida vanílica foi considerada
68 dentro da coleção de amidas preparadas o composto com maior atividade antifúngica. Não existem muitos estudos de atividade antimicrobiana sobre os compostos benzoicos. Porém um estudo desenvolvido por REDDY, RAVINDER & KANJILAL (2012) demonstra que tanto derivados ferúlicos como derivados vanílicos possuem atividade antifúngica sobre espécies do gênero Candida.
Segundo um estudo de ALVES e colaboradores (2013) feito por meio de docking a partir da estrutura 3D da proteína PBP2a (transpeptidase de bactérias resistenstes a β-lactâmicos) e testes in vitro de batérias Gram-positivas e Gram- negativas, a presença de grupos hidroxilas nas posições orto e para como também a presença de metoxila em posição meta no anel benzênico são importantes para atividade antimicrobiana de compostos fenólicos de estrutura química cinâmica e benzoica. A partir dessa correlação com estudo de ALVES e colaboradores (2013), seria previsto que existe uma importância de grupos hidroxilas e/ou metoxilas nos anéis aromáticos de NR14, NR15.
Os fungos foram mais sensíveis a NR15 do que a seus análogos fluorado NR21 e bromado NR22, sugerindo que as amidas cloradas têm um perfil antifúngico mais específico. Além disso, ALVES e colaboradores (2013) descrevem que a presença de grupos hidroxilas nas posições orto e para bem como a presença de metoxila em posição meta são importantes para atividade antimicrobiana. Diante desses resultados, pode dizer que a amida derivada do ácido vanílico foi eleita a 4-clorobezilamida com o melhor perfil antifúngico por ter em sua estrutura uma metoxila em meta, uma hidroxila em para e um cloro no anel básico da estrutura.
Considerando que amida vanílica apresentou melhor efeito inibitório sobre as cepas fúngicas, foram preparados vários derivados a partir dessa amida com a finalidade de obter uma amida com melhor perfil antifúngico e avaliar a contribuição da hidroxila a atividade biológica. Conforme é mostrado na Tabela 19 (pag 71), os derivados da amida do ácido vanílico não apresentarem atividade antifúngica sobre as cepas testadas. Esse resultado indica que substituintes na forma de ésteres como acetilado (AC1), benzoato (AR1), o fenilacetato (AR2), o valerato (AR3) e 3-bromobenzoato (AR4) e grupos éteres tais como 4-metil-fenóxido (AK1), 4-hidroxi-fenóxido (AK2), 1- propanóxido (AK3), 2-propanóxido (AK4) e 1-pentilóxido (AK5), decilóxido(AK6) na posição 4 de NR15 não causa algum efeito inibitório sobre as cepas fúngicas. A
69 proteção da hidroxila com estes substituintes tornou a amida inativa e evidenciou a importância da presença do OH na posição 4 do anel aromático.
70 CIMb (µg/mL) / Leveduras NR1-NR11 NR12-NR22 Composto R1 R2 R3 R4 R5 Candida albicans ATCC-76645 Candida albicans LM-106 Candida albicans LM- 23 Candida tropicalis ATCC-13803 Candida tropicalis LM-36 Candida krusei LM-13 Candida krusei LM-656 NR1 - - - - Cl 1024 1024 1024 512 512 + 1024 NR2 - OH OH - Cl 256 256 256 512 1024 512 512 NR3 - OCH3 OH - Cl 256 256 256 512 512 512 512 NR4 - - OCH3 - Cl + + + + + + + NR5 OH - - - Cl 256 256 256 512 512 1024 1024 NR6 - OH - - Cl 256 256 256 512 512 1024 1024 NR7 - - OH - Cl 1024 1024 512 + + + 1024 NR8 - - Cl - Cl + + + + + + + NR9 - OCH3 OH OCH3 Cl + + + + + + + NR10 NO2 - - - Cl 256 256 256 256 256 512 512
NR11 - OCH3 OCH3 OCH3 Cl + + + + + + +
NR12 - - - - Cl + + + + + + + NR13 - - C6H5 Cl + + + + + + + NR14 - OH OH OH Cl 256 256 512 512 512 256 256 NR15 - OCH3 OH - Cl 512 256 256 256 256 256 256 NR16 - OCH3 OH OCH3 Cl + + + + + + + NR17 - - OH - Cl + + + + 1024 + 256 NR18 - C(CH3)3 OH C(CH3)3 Cl + + + + + + + NR19 OH - - OCH3 Cl + + + + + + + NR20 - CH3 - NO2 Cl + + + + + + + NR21 - OCH3 OH - F 512 512 512 + + 1024 1024 NR22 - OCH3 OH - Br + + + + + + + Nistatina - - - 3,125 3,125 3,125 3,125 3,125 3,125 3,125
71 HALO DE INIBIÇÃOb
Composto R Candida albicans
ATCC-76645 Candida albicans LM-106 Candida albicans LM- 23 Candida tropicalis ATCC-13803 Candida tropicalis LM-36 Candida krusei LM-13 Candida krusei LM-656 AR1 C6H5- + + + + + + + AR2 C6H5CH2- + + + + + + + AR3 CH3(CH2)3- + + + + + + + AR4 3-Br-C6H4- + + + + + + + AK1 4-Me-C6H4CH2- + + + + + + + AK2 4-OH-C6H4CH2- + + + + + + + AK3 CH3(CH2)2- + + + + + + + AK4 (CH3) 2CH2- + + + + + + + AK6 CH3(CH2)8CH2- + + + + + + + AC1 CH3 + + + + + + + Nistatina - 3,125 3,125 3,125 3,125 3,125 3,125 3,125
72 4.4.2. Relação estrutura atividade quantitativa do estudo antifúngico I
O Volsurf+ 1.0.7 gerou 128 descritores em conjunto com a variável dependente (classificação binária), que descreve se o composto é ativo (A) ou inativo (I). Esses dados foram utilizados como entrada para o software KNIME v. 3.1.0. É importante salientar que a geração de descritores é relativamente rápida, para todas as 32 amidas que os conjuntos de dados de treino compreendem a geração de todos os 128 descritores por Volsurf+ levou menos de 1 minuto, utilizando um computador equipado com um processador i7, rodando a 3.4GHz e equipado com 12 GB de memória RAM.
A Tabela 20 (próxima pag) resume os índices estatísticos do modelo de Treino para a formação e a validação cruzada em todos os ensaios antifúngicos. Para a validação, a árvore de decisão gerou altas taxas de acertos para os compostos inativos que estavam acima de 83,3% e baixas taxas para os compostos ativos, 22,2%. Para a validação cruzada, o modelo apresentou desempenho semelhante ao conjunto de treinamento. A especificidade (verdadeiro negativo) foi maior que a sensibilidade (verdadeiro positivo). Isso significa que no geral, houve uma menor percentagem de falso positivo em relação verdadeiro positivo na predição, o que mostra que o método se mostra com predição de bom desempenho. Os resultados podem ser visualizados na Tabela 20.
73 Tabela 20. Resumo do treinamento, validação cruzada interna, e os resultados dos acertos correspondentes, que foram obtidos utilizando método de validação leave-one- out sobre o conjunto total de 32 haloamidas submetidos a testes antifúngicos.
C. albicans LM- 23
Treino Validação
Amostras Acerto %Acerto Acerto %Acerto
Ativo 10 3 30.0 3 30,0
Inativo 22 19 86.4 19 86,4
Total 32 22 68,8 22 68,8