Komparativt verdiestimat

A produção de biossurfactante representa uma etapa importante nesse trabalho pelo fato de ser aplicada aos ensaios de biodegradação subsequentes.

4.1.1. Preparo e seleção dos meios de cultura

O microrganismo utilizado para a produção de surfactante foi o Bacillus

subtilis ATCC 6633, originalmente conservado sob refrigeração (4°C) em meio

Nutrient Agar (NA) de acordo com Difco (1984). O microrganismo foi reativado em meio Caldo Nutriente (CN), de acordo com a Tabela 6, por 24 h e inoculado (1 mL) em frascos erlenmeyer de 250 mL, cada um contendo 100 mL dos meios da Tabela 6. Os frascos foram incubados a 35°C emincubadora Shaker Solab com agitação a 180 rpm para quantificação do crescimento de B. subtilis (Figura 11). As pesagens foram realizadas com auxílio da balança analítica Sartorious BL201 S. Os reagentes utilizados na preparação dos meios eram das marcas Sigma, Synth, Vetec e Dinâmica todos PA. O caldo BHI utilizado foi o da marca Criterion.

Figura 11 – Frascos incubados a 35°C em incubadora Shaker Solab com agitação a 180 rpm para crescimento de B. subtillis e produção de biossurfactante.

Nesta primeira etapa foi selecionado o meio de cultura que mais produziu biomassa para dar prosseguimento às próximas etapas de produção de biossurfactante, admitindo que exista uma relação diretamente proporcional entre biomassa e produção de biossurfactante, conforme consta nos trabalhos de Vater (1986).

Tabela 6 – Meios de cultura utilizados para crescimento de B. subtilis Meio líquidos e sólidos Componentes e concentração

NA (Nutrient Agar) 3,0 g.L-1 _{de extrato de carne, 5,0 g.L}-1 _{de peptona, 8,0 g.L}- 1 _{de NaCl e 15 g.L}-1 _{de ágar} BH (Bushnell Haas) caldo 0,2 g.L -1 _{de MgSO} 4, 0,02 g.L-1 de CaCl2, 1,0 g.L-1 de KH2PO4, 1,0 g.L-1 de K2HPO4, 1,0 g.L-1 de NH4NO3 e 0,05 g.L-1 _{de FeCl} 3 BH + Óleo caldo 0,2 g.L -1 _{de MgSO} 4, 0,02 g.L-1 de CaCl2, 1,0 g.L-1 de KH2PO4, 1,0 g.L-1 de K2HPO4, 1,0 g.L-1 de NH4NO3, 0,05 g.L-1 _{de FeCl} 3 e 1mL de óleo

CN (Caldo nutriente) 3,0 g.L-1 de extrato de carne, 5,0 g.L-1 de peptona e 8,0 g.L-1 de NaCl

BHI (Brain heart infusion)

caldo

14,5 g.L-1 _{de caseína, 10 g.L}-1 _{de infusão de coração e}

cérebro, 5 g.L-1 de peptona, 3,0 g.L-1 de NaCl, 2,5 g.L-1 de Na2HPO4 e 2,0 g.L-1 de glicose

BHI + Mg 14,5 g.L-1 de caseína, 10 g.L-1 de infusão de coração e cérebro, 5 g.L-1 _{de peptona, 3,0 g.L}-1 _{de NaCl, 2,5 g.L}-1 _de

Uma alíquota de 1 mL dos meios foi retirada para contagem em placa utilizando o meio PCA (Plate Count Agar) de acordo com Difco (1984). Foi também feita coloração de Gram, para verificação do crescimento de B. subtilis.

4.1.2. Determinação de biomassa

Para determinação da biomassa foram preparados 18 frascos erlenmeyers contendo caldo BHI+Mg conforme 4.1.1 para o crescimento de B. subtilis. A cada 4 h um dos frascos erlenmeyer na incubadora Shaker Solab teve seu conteúdo retirado, seu volume foi transferido para tubos de centrifugação e centrifugado a 1,9 x 104 g (16000 rpm) por 30 min utilizando uma centrífuga MLW Modelo K24. Totalizando 12 frascos erlenmeyers nas primeiras 48 h, um frasco foi retirados a cada 4 h. Posteriormente, os 6 frascos restantes na incubadora Shaker Solab foram retirados a cada 24 h de forma que o último frasco foi retirado após 168 h do início do crescimento microbiano (Figura 12). Todos os frascos foram centrifugados e o sobrenadante retirado.

Figura 12 – Esquema da separação de biomassa e sobrenadante após crescimento de B. subtilis em BHI + Mg.

O processo de centrifugação foi necessário para extrair o surfactante intracelular. Desta forma, o sobrenadante dos tubos centrifugados apresentando biossurfactante foi coletado.

Os tubos da centrífuga de massa conhecida sem sobrenadante foram deixados em vácuo por 48 h para secagem e foi possível determinar a biomassa produzida.

4.1.3. Medida de tensão superficial

As medidas de tensão superficial em cada um dos tempos de retirada de frascos erlenmeyer foram obtidas com o uso do tensiômetro de bancada Krüss modelo K6 (Figura 13), que permite a leitura analógica pelo método de anel de platina-irídio de 6 cm de circunferência em um vaso de vidro com 50 mm de diâmetro onde foi colocada a amostra, com indicação direta em mN/m. Para que o equipamento funcione é aplicada uma força ao anel por um disco giratório. A força necessária para que o anel se desprenda no líquido é a tensão superficial do líquido analisado. As medidas de tensão superficial foram feitas diretamente nos sobrenadantes coletados após a centrifugação do meio de cultura contendo B.

subtilis.

Figura 13 - Tensiômetro de bancada Krüss modelo K6 (esquerda) e detalhe do anel de platina-irídio na superfície do liquido no qual a tensão superficial é medida.

4.1.4. Rendimento do surfactante

O surfactante bruto foi isolado do caldo livre de células obtido em 4.1.2 através da precipitação ácida (QUEIROGA et al., 2003; NITSCHKE et al., 2004; DEHGHAN-NOUDEH et al., 2005) ao ajustar o pH para 2,0 utilizando HCl 6 M e mantendo o caldo a 4°C por 24 h. O precipitado formado contendo biossurfactante foi então coletado, centrifugado a 2100 g por 20 min, seco e pesado (Figura 14).

Figura 14– Esquema da precipitação ácida.

4.1.5. Extração e ressolubilização

Para extração do surfactante, foi adicionado 10 mL de solvente diclorometano ao “pellet” obtido em 4.1.4 e agitado de tubos Phoenix AP56 por 5 minutos. Após a solubilização do pellet, a fase orgânica foi retirada e colocada em capela sob aquecimento para evaporação do solvente. O pó branco amarelado resultante do “pellet” foi então ressolubilizado em água alcalinizada a pH 11,0 com NaOH 6 M e utilizado como surfactante (Figura 15). Esse procedimento garante uma sua pureza de 52% a 55% de acordo com os trabalhos de Chen e Juang (2007) e Gong et al. (2009), que analisaram a substância obtida a partir desse método por cromatografia líquida em alta pressão (HPLC).

Figura 15 – Esquema da extração e ressolubilização.

4.1.6. Teste de Emulsificação E24

Para investigar possíveis aplicações do biossurfactante obtido por B. subtilis procedeu-se um de atividade emulsificante. Uma emulsão é formada quando uma fase líquida é dispersa como gotas microscópicas em outra fase contínua líquida, sendo que as ambas as fases são imiscíveis entre si (DESAI e BANAT, 1997). Por esse motivo, não foi testada a atividade emulsificante em fenol, já que esta substância é solúvel no meio de cultivo onde estava o biossurfactante e por isso impossível de se observar alguma fase líquida imiscível. A capacidade de formar emulsões das diferentes substâncias analisadas nesse estudo (petróleo e derivados, óleos vegetais e biodiesel) em contato com o biossurfactante produzido foi medida pelo índice de emulsificação E24.

O índice de emulsificação (E24) foi medido pela adaptação do método

incialmente descrito por Cooper e Goldenberg (1987), utilizado por Ilori et al. (2005). A atividade do biossurfactante em diferentes substâncias foi avaliada ao adicionar a tubos de ensaio 2 mL do meio de cultura fermentado por 48 h livre de células (centrifugado) obtido em 4.1.2 e 2 mL da substância a ser analisado (Figura 16). O índice de emulsificação foi calculado para as seguintes substâncias: petróleo cru, óleo lubrificante sintético, óleo lubrificante usado, óleo diesel, gasolina, querosene, fenol (80 g.L-1_{), óleo de soja, óleo de soja usado e biodiesel B100. O teste foi}

Figura 16 – Montagem dos testes para medida do índice de emulsificação (E24).

O conteúdo dos frascos foi agitado em agitador de tubos (vórtex) por 1 min em alta rotação. Após 24 h calculou-se a razão entre a altura da região emulsificada e altura total (Equação 1), após medição com régua. O teste do índice de emulsificação foi realizado em duplicata.

(1)

sendo Hem a altura da região emulsificada e Hs a altura total da solução.

4.2. Respirometria

Neste estudo foi utilizada uma metodologia de respirometria de Bartha e Pramer (1965) adaptada ao meio aquoso. Utilizando-se essa metodologia é possível determinar informações a respeito das concentrações de CO2 da atmosfera criada

no interior do respirômetro como evidência indireta de biodegradação.

4.2.1. Preparo dos reagentes

Água destilada foi fervida durante 30 min, evidenciando a redução da solubilidade dos gases no líquido. Transcorrido este período, esperou-se o resfriamento para utilização da água na coleta de dados dos respirômetros. Para obtenção de uma solução 0,2 M de KOH (Synth PA) dissolveram-se 11,2 g de KOH em 1000 mL de água isenta de CO2. Guardou-se a solução em recipiente plástico.

Medição