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Na via mitocondrial ou intrínseca (Figura 1.4), por outro lado, os estímulos de morte celular, como a radiação, ROS, infecções virais, compostos anti-tumorais, entre outros, promovem sinais intracelulares que actuam directamente ao nível da mitocôndria (Mondal et al., 2012; Elmore, 2007). A permeabilidade da membrana mitocondrial externa é dependente de proteínas da família Bcl-2, cuja acção culmina na libertação de determinadas proteínas pró-apoptóticas do espaço intermembranar mitocondrial para o citoplasma (Chipuk e Green, 2008; Saelens et al., 2004). Proteínas da família Bcl- 2 dividem-se em pró-apoptóticas sendo exemplo destas a Bax, e em anti-apoptóticas, como é o caso da Bcl-2 (do inglês, B-cell lymphoma protein 2) (Elmore, 2007; Meyers et al., 2004). Bcl-2, ao estabelecer ligação com a proteína Bax, inibe a sua actividade pró-apoptótica (Edlich et al., 2011; Gonzalez et al., 2001). Bax, por sua vez, tem também a capacidade de inibir a proteína Bcl-2 (Edlich et al., 2011; Chipuk e Green, 2008). A proporção entre os níveis citoplasmáticos destes dois grupos de

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proteínas define se a célula entra em apoptose (predominância de proteínas pró-apoptóticas) ou se sobrevive (predominância de proteínas anti-apoptóticas) (Elmore, 2007; Gonzalez et al., 2001).

A proteína Bax tem a capacidade de, ao ser translocada para a membrana mitocondrial externa e sofrer oligomerização, induzir a formação de poros membranares, que por sua vez levam à libertação de citocromo c e da proteína SMAC/DIABLO (do inglês, Second mitochondria-derived activator of caspase/Direct IAP-bind protein with low pI) para o citoplasma (Edlich et al., 2011; Chipuk e Green, 2008; Ray et al., 2005; Saelens et al., 2004). O citocromo c, quando presente no citoplasma, tem a possibilidade de estabelecer ligação com a proteína citosólica Apaf-1 (do inglês, Apoptotic protease activating factor 1), que é precedida pela ligação da procaspase-9, estabelecendo-se assim um complexo proteico, designado por apoptossoma, que leva à activação da caspase-9 (Chipuk e Green, 2008; Meyers et al., 2004). A caspase-9 activa subsequentemente caspases efectoras, como as caspases-3, -6 e -7, o que encaminha o processo apoptótico para a fase de execução (Chipuk e Green, 2008; Meyers et al., 2004).

Os agentes quimioterapêuticos que conseguem induzir a morte celular por apoptose em células tumorais, nas quais o processo está desactivado, fazem-no pela via mitocondrial (Mondal et al., 2012; Lacour et al., 2004).

Figura 1.4 – A via intrínseca ou mitocondrial da apoptose é dependente da razão entre os níveis citoplasmáticos das proteínas Bcl-2 (anti-apoptótica) e Bax (pró-apoptótica), sendo a activação da última essencial à progressão do processo apoptótico (Adaptado de http://www.bumc.bu.edu/phys-biophys/people/faculty/akey/akey- laboratory/projects/apoptosomes/, acedido em Agosto de 2012).

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1.2.2. Efeito Supressor de Tumores de p53

O gene supressor tumoral TP53 é considerado como o ‘guardião do genoma’, ao promover a manutenção da estabilidade do genoma (Amaral et al., 2010; Gonzalez et al., 2001). Mutações somáticas neste gene são contabilizadas como as alterações genéticas mais comuns durante a génese tumoral, estando presentes em mais de 50 % de todos os cancros registados em humanos (Amaral et al., 2010; Elmore, 2007; Slee et al., 2004; Nakano e Vousden, 2001).

A acumulação de p53, após um sinal de stress, deve-se principalmente à grande estabilidade alcançada por esta proteína, como o resultado de modificações pós-traducionais, bem como da reduzida interacção entre esta e a sua reguladora, a proteína oncogénica Mdm2 (do inglês, murine double minute 2) (Slee et al., 2004). Mdm2 apresenta-se como um alvo transcripcional de p53, promovendo, assim, uma auto-regulação entre p53 e Mdm2 realizada em loop de feedback negativo, que controla a progressão do ciclo celular e a indução de morte por apoptose (Amaral et al., 2010; Alarcon-Vargas e Ronai, 2002).

A activação e estabilização da proteína p53 promove o desencadear de vários eventos celulares, como a paragem do ciclo celular, mecanismos de reparação do DNA, diferenciação celular, apoptose, inibição da angiogénese e senescência, que em combinação permitem a inibição do crescimento tumoral e a promovem a sensibilidade aos agentes quimioterapêuticos (Amaral et al., 2010; Slee et al., 2004; El-Deiry, 2003; Vousden e Lu, 2002). Estas respostas celulares são desencadeadas por muitos estímulos de stress, tais como lesões no DNA, como as produzidas por agentes citotóxicos, activação de oncogenes, hipóxia/anóxia, perda de sinais de sobrevivência ou de suporte, deplecção de ribonucleótidos, presença de agentes inibidores de microtúbulos, redução do tamanho dos telómeros e perda de contacto entre células (Speidel, 2010; Vousden e Prives, 2009; Vousden e Lu, 2002; Wu e Ding, 2002).

Aquando da ocorrência de lesões no DNA, a proteína p53 promove a paragem do ciclo celular, para que decorra a reparação das mesmas, e assim a sobrevivência celular (Amaral et al., 2010; Elmore, 2007; Ghobrial et al., 2005). A paragem do ciclo celular em G1/S é desencadeada pela proteína p21, um inibidor de cinases dependentes de ciclinas, sendo a transcrição do gene que a codifica regulada pela p53 (Meyers et al., 2004; Slee et al., 2004; Fei et al., 2002). Caso as lesões não possam ser devidamente reparadas, p53 induz a morte celular ao desencadear a apoptose (Elmore, 2007; Ghobrial et al., 2005; Gonzalez et al., 2001).

A actividade como supressor tumoral de p53 está fortemente associada à indução do processo apoptótico principalmente pela via mitocondrial, contudo a via de receptor de morte também pode ser induzida por p53 (Amaral et al., 2010; Speidel, 2010; Ghobrial et al., 2005). A indução do processo apoptótico é efectuada segundo vias dependentes e independentes da transcrição induzida por p53 (Figura 1.5) (Amaral et al., 2010).

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A principal via pela qual p53 promove o processo apoptótico deve-se à sua função como factor de transcrição (Amaral et al., 2010; Meyers et al., 2004). A proteína p53 permite a transactivação de genes que codificam para proteínas pró-apoptóticas, como Bax, Puma e Noxa, pertencentes à família de proteínas Bcl-2, e Fas (Amaral et al., 2010; Pietsch et al., 2008; Nakano e Vousden, 2001). A proteína p53 pode, por outro lado, levar à trans-repressão de genes que codificam para proteínas anti- apoptóticas como Bcl-2 e survinina (Pietsch et al., 2008).

Adicionalmente, é conhecida a existência de duas outras vias, dependentes da acção de p53 a nível citoplasmático e mitocondrial, que estão representadas na Figura 1.5 e que se encontram descritas por Amaral e colaboradores (2010). Uma delas resulta da translocação de p53 para a mitocôndria, participando no processo de permeabilização deste organelo (Amaral et al., 2010). A outra via advém da acção de p53 a nível citoplasmático, onde promove a oligomerização e translocação de Bax para a mitocôndria (Amaral et al., 2010).