4.1 Efeito do NaOCl na sobrevivência
Durante o presente estudo os indivíduos foram sujeitos a várias concentrações de NaOCl de forma a saber a consequência de diversas concentrações na sobrevivência da espécie. O NaOCl está descrito como sendo altamente tóxico para humanos, mamíferos e animais aquáticos (www.pesticideinfo.org). Para os humanos, a ingestão de uma concentração igual ou acima dos 10mg/L NaOCl é mortalmente tóxica (www.pesticideinfo.org). Para a maioria dos peixes uma concentração acima das 2,5mg/L NaOCl é mortalmente tóxica (www.pesticideinfo.org).
A exposição periódica de larvas recém eclodidas de tilápia moçambicana a concentrações superiores ou iguais a 2mg/L NaOCl comprometeu a sobrevivência das larvas. Concentrações iguais ou superiores a 5mg/L NaOCl foram mortais e a exposição à concentração de 2mg/L apresentou uma taxa de sobrevivência significativamente diferente dos animais controlo. Por outro lado, concentrações iguais ou inferiores a 1mg/L (exposição periódica) neste estudo não tiveram qualquer efeito na sobrevivência dos indivíduos. Nas larvas que estiveram expostas continuamente a uma concentração de 0,01mg/L NaOCl a sua sobrevivência não foi comprometida.
4.2 Efeito da exposição ao NaOCl na morfologia externa e no
desenvolvimento do esqueleto
Os resultados obtidos demonstraram que os indivíduos tratados com NaOCl apresentaram alteração significativa na morfologia externa e na morfologia do esqueleto das larvas expostas a este composto imediatamente após a eclosão. Registou-se atraso no crescimento, alteração na morfometria corporal e atraso no processo de ossificação do tecido ósseo.
Estes resultados são semelhantes com resultados obtidos em outro trabalho, que estudou o efeito da exposição de efluentes clorados em duas espécies de peixes (Weis et al, 1989). Embriões de Fundulus heteroclitus e Pseudopleuronectes americanus foram expostos a efluentes tratados com cloro. Após a eclosão, as observações feitas demonstraram anomalias no tecido ósseo e um atraso no crescimento das larvas. Em mamíferos as observações são semelhantes. Foi conduzido um estudo para avaliar o efeito do HOCl em embriões de ratos, em que fêmeas grávidas ingeriram água para consumo tratada com HOCl. Ainda durante a gestação as fêmeas foram sacrificadas, os resultados demonstraram uma ossificação incompleta do esqueleto dos embriões (Abdel- Rahman et al, 1982). Estudos feitos com outros compostos clorados apresentaram resultados idênticos. El-Makawy et al (2008), estudou o efeito do cloreto de estanho (SnCl2) em fetos de ratos. O SnCl2 foi administrado no alimento das fêmeas grávidas,
durante a gestação as fêmeas foram sacrificadas, os fetos apresentaram anomalias morfológicas externas e um atraso na ossificação do esqueleto. Em outros estudos em que embriões de rato foram expostos a um composto clorado, cloreto de tributil estanho, apresentaram também um atraso na ossificação do seu esqueleto (Harazono et al, 1986;
Adeeko et al, 2003). Em humanos houve um estudo que comparou o comprimento do corpo e morfometria da cabeça de recém nascidos cujas mães pertenciam a uma população que bebia água tratada com NaOCl e outra população que bebia água que não era tratada com cloro. Os bebés cujas mães bebiam água tratada com NaOCl apresentaram comprimento do corpo e circunferência da cabeça significativamente menores que os bebés da outra população (Källén e Robert, 2000).
4.3 Efeito da exposição do NaOCl na tiróide
Existem inúmeros compostos clorados que têm sido descritos como disruptores da tiróide. A exposição a vários tipos de PCBs reduziu os níveis em circulação da hormona T4 em vários animais (Goldley et al, 1995; Bastomsky, 1997a,b; Zoeller et al, 2000) e
tem causado estados de hipotiroidismo (Brouwer et al, 1999; Crofton et al, 2000; Crofton, 2004). A exposição ao perclorato, na forma de sal ou perclorato de amónia, também causou hipotiroidismo em vários animais (Bradford et al, 2005; Mukhi et al, 2007; Chen et al, 2008). No caso do NaOCl, (como mencionado na secção 1, introdução), alguns estudos demonstraram que mamíferos expostos a este desinfectante, na água ingerida, apresentaram um estado de hipotiroidismo (Bercz et al, 1981; Revis et al, 1985; Revis et al 1986). No entanto, apesar de existirem indícios de que este composto actue como disruptor da tiróide, não existem ainda estudos suficientes que incluam este contaminante na lista de disruptores endócrinos (www.pesticideinfo.org).
Neste estudo nas larvas tratadas com 0,01mg/L NaOCl (exposição contínua) a altura das células e dos respectivos núcleos (tirócitos) dos folículos da tiróide foi significativamente mais pequena que nos indivíduos do grupo controlo, indicando uma hipotrofia das
células. Estes dois parâmetros (altura das células e dos núcleos) estão correlacionados positivamente com o nível de estimulação por parte da hormona estimuladora da tiróide (TSH) sob condições em que a produção das hormonas da tiróide é alterada (Payenter et
al, 1988; Hadley, 2000; Capen et al, 2001). Uma redução da concentração das hormonas
da tiróide em circulação resulta num aumento da secreção da TSH. O inverso, um aumento da concentração das hormonas da tiróide em circulação resulta numa diminuição da secreção da TSH, processo denominado feedback negativo (Payenter et al, 1988; Capen et al, 2001; Bradford et al, 2005). Concentrações elevadas de TSH causam hipertrofia dos tirócitos, enquanto que concentrações baixas de TSH causam hipotrofia dos tirócitos (Hadley, 2000; Bradford et al, 2005).
As modificações morfológicas na tiróide que o tratamento causou resultaram numa hipotrofia das células dos folículos da tiróide, o que indicam um aumento na concentração das hormonas da tiróide em circulação. No entanto, as modificações morfológicas externas e no tecido ósseo estão de acordos com outros estudos que relacionam a exposição ao NaOCl a estados de hipotiroidismo (Bercz et al, 1981; Revis
et al, 1985; Revis et al 1986), uma vez que o hipotiroidismo tem sido associado a atrasos
no crescimento e no processo de ossificação do tecido ósseo de vários animais (Orme et
al, 1985; Bassett et al, 2008; Marino et al, 2008). Salientando-se o facto da importância
das hormonas da tiróide na fase do desenvolvimento larvar (Power et al, 2001), será de esperar que um decréscimo das mesmas provoquem um significativo atraso no desenvolvimento dos indivíduos. Por outro lado, estudos têm demonstrado que o cloro (em forma de ião hipoclorito ou ácido hipocloroso) pode oxidar o iodeto a iodo molecular (Lister e Rosenblum, 1963; Burger e Liebhafsky, 1973; Palmer e Lietzke, 1980; Tian e
Dasgupta 2000). Uma vez que a tiróide apenas tem capacidade para utilizar este composto para a síntese das hormonas da tiróide na forma de iodeto, um decréscimo deste poderá levar a um decréscimo da produção das hormonas da tiróide, resultando num estado de hipotiroidismo. Por outro lado, existe a possibilidade do cloro reagir com moléculas orgânicas que contenham o iodo, afectando a libertação do ião iodeto e substituir o iodeto na molécula (Burger e Liebhafsky, 1973; Palmer e Lietzke, 1980; Revis et al, 1986). Se ocorresse uma substituição nas hormonas da tiróide do iodo pelo cloro, poderia resultar em moléculas não funcionais, ou menos activas se baixasse a sua afinidade aos respectivos receptores nucleares, resultante de uma alteração na conformação da molécula. No entanto, a forma como o NaOCl actua de forma a provocar este efeito ainda permanece desconhecida.
Conhecidos disruptores da tiróide como o perclorato, inibem a síntese das hormonas da tiróide, pela supressão da captação do iodeto por parte do simporte iodo/sódio (NIS), o que leva a um aumento da produção de TSH (Wolff, 1998; Capen, 2001). Este efeito causa hiperplasia das células dos folículos da tiróide (Bradford et al, 2005; Mukhi et al, 2006), o que indica que a presença do contaminante está por um lado a provocar diminuição das hormonas da tiróide, no entanto o organismo está reagir para contrariar esta diminuição com um aumento da secreção da TSH. O que estimula a glândula tiróide a produzir mais hormonas.
O tratamento com o NaOCl causou um atraso no crescimento e um atraso na ossificação do tecido ósseo, o que são indicações do estado de hipotiroidismo dos animais. Por outro lado, estudos anteriores demonstraram que este contaminante provoca estados de hipotiroidismo. Seria assim de esperar uma hiperplasia das células dos folículos da
tiróide, devido ao aumento da secreção da TSH induzida pela diminuição do nível de hormonas da tiróide em circulação (hipotiroidismo). Contudo, o tratamento com NaOCl causou uma hipotrofia das células dos folículos da tiróide. Estas observações sugerem que o NaOCl não só é um disruptor da tiróide, como é provavelmente um disruptor do eixo hipotálamo – hipófise – tiróide, interrompendo ou inibindo de alguma forma o
feedback negativo da TSH. A forma como este mecanismo se processa permanece
desconhecido.
4.4 Atraso na ossificação do tecido ósseo, efeito directo ou indirecto?
As hormonas da tiróide apresentam um papel fundamental no desenvolvimento do tecido ósseo quer de origem dermal, quer de origem endocondral, em humanos e animais (Marians et al, 2003; O’Shea et al, 2005; Bassett et al, 2007; Bassett et al, 2008). Por outro lado, estudos recentes têm demonstrado a importância do eixo hipotálamo – hipófise – tiróide no desenvolvimento do tecido ósseo, nomeadamente o papel da TSH neste processo (Sampath et al, 2007; Bassett et al, 2008). O hipotiroidismo causa um atraso na ossificação do tecido ósseo, por outro lado, uma concentração normal da TSH é importante para um desenvolvimento adequado do esqueleto, pois a TSH inibe a diferenciação dos osteoblastos (Abe et al, 2003; O’Shea et al, 2005; Bassett et al, 2007; Bassett et al, 2008). Os resultados obtidos neste trabalho indicaram que a exposição ao NaOCl pode ter interferido com o eixo hipotálamo – hipófise – tiróide e que houve uma provável diminuição do nível das hormonas da tiróide. Fica por se perceber se o atraso na ossificação do tecido ósseo dos indivíduos expostos ao NaOCl foi resultado de um efeitotóxico que o NaOCl teve no tecido esquelético. Ou em alternativa, causado devido ao efeito que este contaminante provocou na tiróide.
Importa salientar que os mecanismos pelos quais este contaminante actuou de forma a causar as alterações na morfologia destes animais permanecem desconhecidos, sendo necessário que se efectuem trabalhos futuros que possam responder a estas questões. Numa tentativa de se perceber qual o mecanismo fisiológico pelo qual o NaOCl poderá ter provocado um efeito directo, atraso no processo de ossificação do osso, foi estudada a expressão do gene da BMP2, afim de saber se a expressão deste gene importante neste processo foi afectada pelo tratamento. Este gene está envolvido no processo de ossificação do tecido ósseo (Wan e Cao, 2004; Cao e Chen 2005; Leboy, 2006) e não é conhecido que seja regulado pela glândula tiróide. No entanto, no momento em que os animais foram sacrificados a expressão deste gene nos animais tratados não foi significativamente diferente dos animais controlo. Sugerindo que por um lado, o atraso na ossificação não ocorreu pelo mecanismo que envolve esta proteína. Ou por outro lado, no momento em que estes animais foram sacrificados a expressão deste gene já estava estabilizada. É de salientar que o estudo da expressão deste gene foi analisado em animais expostos a uma concentração de 1mg/L NaOCl de exposição periódica. Como o tratamento foi administrado uma única vez, os animais podem ter apresentando o fenótipo, mas ao nível molecular os sinais podiam já ter estabilizado. Concluindo-se que neste estudo, este gene não foi um bom marcador do processo de ossificação.
Será importante o estudo da expressão do gene da fosfatase alcalina e da osteocalcina, pois são genes que regulam processos envolvidos na ossificação do tecido ósseo posteriores à diferenciação nos osteoblastos. Estão envolvidos respectivamente no
processo de produção da matriz óssea e na mineralização desta matriz (Stein e Lian, 1993; Junqueira et al, 1995). O estudo da expressão destes genes poderia indicar se o atraso da ossificação observada ocorreu durante a produção da matriz óssea ou durante a sua mineralização. Por outro lado, estes dois genes são regulados pela hormona da tiróide T3 (Harvey et al, 2003). Se houver diferenças na expressão destes genes, isto pode indicar
que o fenótipo observado no osso pode ter sido um efeito indirecto, resultado do efeito que o NaOCl causou na tiróide.
Por último, o estudo da expressão do gene da TSH poderá ajudar na compreensão de como o eixo hipotálamo – hipófise – tiróide está a responder ao efeito causado pela exposição do NaOCl na glândula tiróide (hipotrofia dos tirócitos: redução da actividade da tiróide). E poderá dar uma indicação se este gene está envolvido no fenótipo observado no osso, dada a sua importância no desenvolvimento do esqueleto.
4.5 Enquadramento ambiental
No trabalho realizado verificou-se que a exposição a concentrações iguais ou acima das 2mg/L NaOCl comprometeram significativamente a sobrevivência dos indivíduos. Por outro lado, uma exposição periódica de 1mg/L e uma exposição contínua de 0,01mg/L NaOCl causaram alterações morfológicas significativas que podem vir a comprometer o desenvolvimento, maturação e reprodução dos animais.
Exemplos de valores legislativos para a concentração de cloro residual são:
- Para as águas de consumo humano, no Brasil em alguns estados recomenda-se um valor de cloro residual de 2mg/L (www.sgc.goias.gov.br).
- Em Portugal para as águas de consumo humano, o valor mínimo recomendado é de 0,2mg/L e o máximo de 0,6mg/L de cloro residual (Decreto – Lei nº 306/2007 de 27 de Agosto). Em piscinas públicas o valor mínimo de cloro residual é de 0,5mg/L e o máximo de 2mg/L (Decreto – Lei nº 121/02 de 3 de Maio);
- No governo Canadiano, os valores máximos de exposição contínua directa por lei permitidos para os organismos aquáticos é de 0,003mg/L de cloro residual, enquanto que para os organismos marinhos o valor máximo permitido é de 0,002mg/L de cloro residual, enquanto que para águas de irrigação o valor máximo de exposição periódica é de 1mg/L de cloro residual (www.env.gov.bc.ca).
Estes valores sugerem que mundialmente a amplitude de valores que pode ser encontrada é elevada. Na União Europeia a indústria do cloro representa 55% da produção de toda a indústria química (www.euractiv.com). A regulamentação que melhore a sustentabilidade ambiental deste sector, que passa pela redução das emissões de efluentes para ambientes aquáticos, não está ainda definida, devido à complexidade do sector (www.euractiv.com).
É por isso muito provável que várias populações de animais possam estar expostas ao intervalo de valores testado neste trabalho que causou modificações importantes nestes animais. Este estudo poderá então contribuir para a regulamentação deste composto.
5. Conclusões
No presente estudo verificou-se que a exposição precoce ao NaOCl provocou efeitos no desenvolvimento larvar desta espécie. Os efeitos observados foram: alterações na morfometria dos animais, atraso no crescimento e na ossificação do tecido ósseo e redução da actividade da tiróide, indicando que o NaOCl poderá ser considerado um potencial disruptor endócrino em peixes.
Ficou por se perceber se o atraso na ossificação do tecido ósseo dos indivíduos expostos ao NaOCl foi resultado de um efeito tóxico que o NaOCl teve no tecido esquelético. Ou se o fenótipo observado no desenvolvimento pode ter sido um efeito indirecto de origem endócrina. Por outro lado, importa realçar que os mecanismos fisiológicos pelos quais este contaminante actuou de forma a causar as alterações observadas permanecem desconhecidos, sendo necessário que se efectuem trabalhos futuros que possam responder a estas questões.
Em última abordagem salienta-se que a concentração mínima de cloro residual que deve ser mantida em águas de piscinas indicada por vários países é de 1mg/L. Foi importante observar que uma única exposição numa fase precoce do desenvolvimento larvar de 1mg/L NaOCl provocou um atraso tão significativo no desenvolvimento do esqueleto. Será de prever que facilmente águas tratadas com cloro sejam directamente descarregadas para sistemas aquáticos devido à falta de legislação específica existente para este assunto. Podendo este estudo contribuir para regulamentação deste composto, no que respeita a exposição do mesmo a organismos aquáticos.
6. Trabalho Futuro
Os efeitos observados no desenvolvimento do esqueleto e na tiróide, poderão comprometer o desenvolvimento em fases posteriores. Tornando-se necessários estudos futuros mais prolongados para se perceber se estes efeitos poderão afectar a sobrevivência na fase adulta e a reprodução destes animais. Em particular, acompanhamento do desenvolvimento até à idade adulta de animais expostos periodicamente ao NaOCl.
Seria importante efectuar estudos da expressão dos genes da osteocalcina, fosfatase alcalina e TSH, numa tentativa de entender quais os mecanismos no processo de ossificação que são afectados pela exposição ao NaOCl. E de que forma o eixo hipotálamo – hipófise – tiróide responde ao efeito causado por este composto na tiróide. O estudo da expressão destes genes também poderia ajudar a responder se os efeitos observados no tecido ósseo foram resultado de um efeito tóxico do NaOCl, ou se poderá ter sido um efeito indirecto, resultado do efeito que o NaOCl causou na tiróide.
A quantificação das hormonas da tiróide também seria um trabalho importante a realizar, pois permitiria entender se de facto, a hipotrofia observada nos tirócitos, que indicam uma redução na actividade da hormona tiróide, tinha resultado de facto num estado de hipotirodismo nos animais expostos ao NaOCl. A identificação destas hormonas por espectrometria de massa também permitirá saber se houve uma transformação química destas moléculas, resultado de uma possível substituição do iodo pelo cloro.
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