3. EMPIRI KAPITTEL
3.2 K ABINETTENE SOM NASJONALE PUNKTER FOR INNFLYTELSE
Os dados do estudo form analisados de forma qualitativa, comparando as amostras do lado esquerdo (controle) com as do lado direito (experimental). As lâminas foram analisadas pelo patologista Dr. Prof. Carlos Benatti Neto do laboratório de Odontologia de Fisiologia e Pa- tologia da Universidade Estatual de São Paulo, (UNESP) da cidade de Araraquara. Segue-se a seqüência das fotos histológicas, com a finalidade de demonstrar os resultados das análises qualitativas. Pode-se observar na Fig.4.1. (A) o corte histológico controle do grupo I, os de- mais representam os grupos experimentais irradiados com 0,5 até 2,0 W/cm2. Os cortes foram
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(A) (B)
(C) (D)
(E) (F)
Figura 4.1: A figura(A) representa o corte histológico do grupo I da amostra do lado esquerdo que nao recebeu irradiação, referencial para comparar os outros cortes que receberam irradiação; a figura(B) mostra o corte histológico da amostra coletada do lado direito, que foi aplicado ultra-som desligado (placebo); a figura (C) referente ao grupo II irradiado com 0,5W/cm2; a figura (D) amostra do grupo III
irradiada com 1,0W/cm2; o corte da figura (E) do grupo IV irradiada com 1,5 W/cm2e o corte histológico
da figura (F) do grupo V irradiada com 2,0 W/cm2; Obserava-se nas figuras (D, E e F) dos cortes his-
tológicos que ocorre um aumento na espessura da epiderme quando comparadas com as figura (A e B), controle e placebo, representado pelas flechas pretas. Os triângulos mostram a alteração nas fibras de colágeno da derme das figuras (D, E e F) quando comparadas com as figuras (A e B). As setas inteiras abaixo da epiderme indicam um discreto infiltrado inflamatório principlmente a partir das figuras (E e F)
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4.1.2 Resultados Quantitativos
A análise dos dados quantitativos foi realizada com a biblioteca de estatística do Excel do Excel e com o programa Bioestat 3.0. Os testes realizados procuraram diferenciar os exper- imentos, indicando possíveis alterações do tecido biológico. Para isso foi realizada a análise de variância ANOVA e o teste "pos hoc"de Tukey aplicados entre os grupos. Ambos testes indicaram que o grupo I possui a menor média na espessura da epiderme (29,25 µm ±6,53), quando comparado com os grupos III (40,62 µm ±9,49), IV (45,32 µm ±9,43) e V (43,91 µm ±9,55) e as diferenças significativas (p < 0,01). Estes dados mostram que os grupos irradiados com intensidades mais elevadas apresentaram as maiores médias.
Figura 4.2: O gráfico ilustra as duas medidas realizadas separadamente do lado direito e es- querdo das amostras.
4.2 Discussão
As altas intensidades utilizadas em tratamentos estéticos é uma das principais preocupações deste estudo. Sabe-se que o ultra-som é utilizado com muita freqüência nas clínicas, para fins terapêuticos e estético. Entretanto, pesquisas revelam dados infundados referentes à intensi- dade, tempo de exposição e as condições de calibragem dos aparelhos de ultra-som (SPEED, 2001). Observa-se na prática clínica que há uma dificuldade de programar uma dosimetria de ultra-som adequada aos diferentes casos por parte dos profissionais. Verifica-se esta dificul- dade no estudo de (STUART; JOAN, 2002) sobre o uso e dosagem do ultra-som na fisioterapia
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disportiva. O objetivo dos autores foi investigar o uso e a dosagem do ultra-som terapêutico utilizada pelos fisioterapeutas australianos com interesse direcionado para as lesões no esporte. Distribuíram 355 questionários, divididos em quatro sessões: características terapêuticas, uso do ultra-som, dose do ultra-som e questões finais. Os autores concluíram que apesar da grande freqüência de uso do aparelho nas clínicas, existem poucas diretrizes adequadas sobre o uso e a dose do ultra-som terapêutico na prática clínica.
Percebe-se também, grandes problemas metodológicos dos estudos sobre ultra-som tera- pêutico. Em uma pesquisa investigando 35 artigos, entre 1975 e 1999, sobre os efeito do ultra- som terapêutico baseada em testes controlados randomizados apenas 10 estavam nos padrões metodológicos aceito (BAKER; ROBERTSON., 2001).
Outro fator que dificulta a exatidão das pesquisas esta realcionado com o fator da calibração do aparelho. (GUIRRO et al., 1997) pesquisou a intensidade acústica média temporal e média espacial dos aparelhos de ultra-som utilizados nas clínicas da cidade de Piracicaba, com o ob- jetivo de analisar se haveria alguma diferença entre a intensidade que o painel do equipamento registra com a intensidade distribuída do transdutor. Mostrou que a maioria dos equipamentos emitiam energia acima de 30%, ultrapassando o valor das especificações propostas pela norma. Outro estudo com objetivo de avaliar a calibragem dos equipamentos de ultra-som utilizados nas clínicas, pesquisando nas diferentes intensidades (0.5, 1.0 1.5 e 2.0 W/cm2). Os autores
concluíram que dos 83 aparelhos aferidos, um terço estava fora dos padrões medidos, sendo necessário melhorias nas condições de funcionamento dos aparelhos de US para se ter confia- bilidade na aplicação e nos resultados (ARTHO et al., 2002).
Pode-se observar o quanto é preocupante as altas intensidades, conforme o estudo de (ARA- UJO et al., 2003) sobre o efeito do ultra-som na veia auricular de coelhos, que apresentou como objetivo avaliar o risco potencial do ultra-som no sistema venoso. Foi constatado que com in- tensidade de 3 W/cm2no modo contínuo houve a indução de trombose venosa e um aumento
dos linfócitos de forma significativa, podendo ser observada macroscopicamente por apresen- tar edema, eritema e calor. As imagens do trabalho evidenciam lesão na parede vascular com extravasamento de células.
Por outro lado, em certos tratamentos as intensidades mais altas são eficazes. Como no estudo de (NG et al., 2003), que avaliaram os efeitos do ultra-som terapêutico nas propriedades estruturais e funcionais na cicatrização do tendão de aquiles. Foram divididos em 3 grupos: Controle, grupo de baixa dose irradiados com intensidade de 1.0W/cm2 e grupo de alta dose utilizando 2.0W/cm2. Os autores concluíram que houve um aumento significativo das pro-
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grupo controle. Consideraram que baixas doses e altas doses do ultra-som terapêutico aceleram o processo de cicatrização do rompimento de tendão. Diante destes resultados torna-se impor- tante salientar que não foram avaliados os tecidos mais superficiais como epiderme e derme.
Neste sentido, resultados obtidos por (CUNHA; PARIZOTTO; VIDAL, 2001) demon- straram que na comparção de ultra-som contínuo e pulsado em baixa intensidade, o primeiro provocou no tendão pioras na reparação tendínea, enquanto na forma pulsada, houve uma ace- leração na fibrilogênese cerca de 90% superior ao controle. Isso mostra os riscos de se utilizar doses elevadas na forma contínua de ultra-som para tratamento em tecidos profundos. Pode- se imaginar que na trajetória da onda sonora possa ter havido alterações teciduais também, porém não foram avaliados neste trabalho. Os trabalhos (DYSON; POND; WARICK., 1968) e (DYSON, 1987) mostram que uma cicatrização de melhor qualidade e em condições mais adequadas para os tecidos com doses baixas do ultra-som, onde se reduzem os efeitos térmicos mais pronunciados. Os autores sugerem doses abaixo de 0,5 W/cm2.
Diante dos resultados obtidos no presente estudo, sugere-se que a aplicação do ultra-som também gerou alterações no tecido epitelial sadio de ratos Wistar. Obteve-se um notório au- mento na espessura da epiderme conforme a figura 4.1 (C, D, E e F). Isso provavelmente ocorreu por estímulo na mitose das células da camada basal da epiderme. As evidências encontradas nos resultados apresentam uma relação com o trabalho realizado por (SILVA, 2007), que avaliou o efeito do ultra-som pulsado na atividade mitótica androgênica das células de Leydig, levando a um aumento na velocidade do ciclo celular. Estas evidências mostram o papel da camada proli- ferativa da epiderme no processo de renovação celular, que mostrou ser susceptível à influênica da energia do ulta-som.
No estudo de (BOUCAUD et al., 2001) os autores também encontraram alterações no tecido epitelial. Eles pesquisaram o efeito biológico que o ultra-som pode causar com a fonoforese. As amostras de pele in vitro, que foram irradiadas acima de 2,5 W/cm2apresentaram lesão.
Realizaram também, em tecido epitelial de ratos in vivo e constataram lesões mais profundas, entre as quais necrose capilar e muscular. Tais dados corroboram os achados deste trabalho.
Conforme a análise histológica do presente estudo, também observou-se alterações das fi- bras localizadas na região da derme. Na figura 4.1 (D, E e F) pode ser observada a ocorrência do seu adelgaçamento, podendo indicar uma perda da resistência mecânica da pele. Este adelgaça- mento pode de certa forma gerar uma desorganização das fibras. Resultados parecidos foram constatados no trabalho realizado por (VISNARDI., 2007), que pesquisou o efeito do ultra- som de baixa intensidade em colágeno da pele sadia de ratos e mostrou por meio da análise de birrefringência textural (intrínsica), que houve uma desorganização das fibras colágenas, prin-
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cipalmente na camada mais profunda da derme.
Outra alteração presente neste estudo foi a observação de um discreto infiltrado inflamatório abaixo da epiderme das amostras irradiadas acima de 1 W/cm2, o que pode estar relacionado com o aumento da temperatura tecidual local. Este aumento de temperatura pode se relacionar ao comportamento do campo acústico do ultra-som que apresenta-se de forma irregular. Devido a isso, pode acontecer picos de intensidade gerando maior aquecimento em algumas regiões do tecido.
Neste trabalho, a coleta do material foi realizada no mesmo dia após a última aplicação do US. Com isso pode-se considerar que as alterações obtidas no tecido epitelial sejam de um caráter mais agudo. No entanto é importante salientar que estas alterações ocorreram com apenas 4 dias de aplicação. Já nos tratamentos estéticos, geralmente são realizados mais de 20 sesssões com intensidades bastante altas (nas faixas entre 2.5 à 3.0 W/cm2), maiores do que as utilizadas neste trabalho.
Conforme os resultados morfométricos apresentados na figura 4.2, observou-se um aumento linear em relação às medidas da espessura da epiderme até a intensidade de 1.0 W/cm2. Nos grupos irradiados com 1.5 e 2.0 W/cm2, este aumento foi mantido. Aparentemente houve uma
resposta máxima de mitose nas células da camada basal, resultando em espessuras semelhantes ao final dos 4 dias de tratamento. Em um trabalho de revisão de literatura sobre dosimetria do ultra-som (BLUME et al., 2005), relatam que as altas dosagens como 1.5 e 2.0 W/cm2, podem ser menos efetivas do que as doses baixas. Além disso, os autores chamam a atenção que nas aplicações clínicas se observa evidências de que as altas intensidades não são tão eficientes. Diante disso, sugerem que os profissionais preferencialmente utilizem subdoses do que super- doses, por serem mais efetivas e correrem menor risco de lesão.
Além de apresentar uma escassa literatura sobre efeitos do ultra-som no tecido sadio, faz-se necessário mais estudos clínicos dos efeitos biofísicos do ultra-som (BAKER; ROBBERTSON; ., 2001). Portanto, sugere-se com os resultados deste estudo, que haja uma grande precaução no uso do ultra-som, especialmente nos tratamentos estéticos, cujas doses são elevadas, o que pode ocasionar lesões, algumas delas internas, que só deverão aparecer as consequências algum tempo depois.
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Conclusão
Os resultados obtidos neste estudo indicaram que o ultra-som em tecido sadio de ratos al- tera as estruturas do tecido epitelial. Foi observado que houve um aumento na espessura da epiderme. Isso pode estar relacionado com o estímulo da mitose das células da camada basal localizadas na epiderme. O discreto processo inflamatório observado abaixo da epiderme, pode ter sido pelo comportamento irregular do feixe do campo próximo do ultra-som, isso pode gerar picos de intensidades levando a um aumento da temperatura local. Mostrou-se também, um adelgaçamento das fibras podendo indicar uma redução da resistência da pele. Em re- lação às intensidades aplicadas em cada grupo, constatou-se que a partir de 1 W/cm2houve uma manutenção da grande espessura da epiderme evidenciado já com doses inferiores. Isso pode indicar o limite de exposição a ser utilizado, evitando aplicações com intensidades maiores, pois poderia causar lesões importantes nos tecidos profundos. Sugere-se estudos que observem os efeitos de longo prazo das aplicações de ultra-som, a fim de verificar as alterações per- manecerão e como ocorre o processo de reparo destas lesões mais cronicamente determinadas. Diante disto, torna-se relevante maiores estudos do ultra-som nos tecidos sadios, avaliando estas alterações morfológicas e bioquímicas, e principalmente os mecanismos de ação que geram tais modificações, por meio de técnicas de biologia molecular, antes de ser aplicado amplamente nos tratamentos estéticos, como hoje acontece.
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Apêndice
6.1 Apêndice (A)
Rotina Histológica e Coloração
As amostras saem do formal 10% e são lavadas durante 24h em água corrente. São então mantidaas em álcool 70%. Para se realizar a inclusão em parafina as peças são desidratadas em uma seqüência de banhos em álcool. Alguns protocolos costumam passar por um banho de 1 hora em álcool 80%, outros de 1 hora em álcool 90% e depois uma seqüência de banhos em álcool absoluto. Nas amostras foram utilizadas álcool 70% para o absoluto diretamente. Foram feitos de 7 a 8 banhos de 1 hora cada em álcool absoluto, posteriormente mais 1 hora em álcool (xilol), mais 1 hora no primeiro banho de xilol e um absoluto finalmente um último banho em xilol por mais 1h.
Retira-se o excesso de xilol das peças com a ajuda de papel absorvente e imediatamente as peças são colocadas no primeiro banho de parafina derretida 60o C. As peças permaneceram nesse banho por pelo menos 2 horas, depois foram transferidas para um segundo banho em parafina de boa qualidade e colocadas numa estufa a vácuo por mais 2 horas. Só então foram confeccionados os blocos. Depois de solidificada e fria estão prontos para se obter os cortes.
Os cortes histológicos foram realizados na Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), no departamento de Fisiologia e a coloração das lâminas em heosina e hematoxilina foi realizada no departamento de hidrobiologia. As lâminas foram avaliadas pelo patologista da Universidade Estadual de São Paulo (UNESP).
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6.2 Apêndice(B)
Tabelas com as medidas da espessura da epiderme do lado esquerdo e direito das amostras. Medidas Epiderme (LE)
(GI) (GII) (GIII) (GIV) (GV) 14,27 7,07 14,13 9,51 12,37 12,49 9,01 12,37 14,57 12,74 16,00 8,83 15,9 12,86 14,24 14,3 9,99 14,29 12,49 11,85 12,86 11,31 8,83 12,57 19,43 17,87 12,37 14,57 17,67 15,2 16,29 10,6 18,02 15,2 15,2 16 11,85 17,67 14,24 21,27 12,86 10,6 17,67 7,07 12,37 11,31 5,30 18,45 9,01 19,51 10,6 9,51 22,97 9,01 16 12,49 10,6 10,6 10,3 15,8 12,37 7,07 19,75 14,13 14,57 10,6 8,83 14,13 14,24 17,76 10,6 9,51 17,67 16 13,8 8,83 10,6 16 15,9 17,4 12,49 9,51 10,6 12,49 22,97 12,37 7,07 10,6 10,3 19,43 13,8 8,83 10,6 12,74 22,59 12,37 10,6 12,49 10,6 18,02 12,49 10,6 14,24 18,45 17,76 9,01 12,37 11,31 15,1 16,29 12,74 12,49 13,84 10,75 15,8 14,13 9,51 16,29 12,37 15,8 Média 12,88 9,68 14,70 12,9 16,6 Desvio Padrão 2,21 1,82 3,47 2,9 3,12
Tabela 6.1: A tabela, demonstra as 4 medidas em micrômetro realizadas em todas as amostras na epiderme de cada grupo do lado esquerdo e também a média e desvio padrão de cada uma
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Medidas Epiderme (LD)
(GI) (GII) (GIII) (GIV) (GV) 38,91 38,91 60,48 44,6 44,17 31,85 33,75 43,74 40,64 58,33 17,76 39,03 46,07 49,47 37,14 23,04 31,46 34,12 35,51 44,47 32,16 34,98 37,14 37,48 64,21 21,27 35,8 28,27 54,8 55,87 36,38 29,98 29,25 53,27 55,6 33,19 26,06 31,85 42,64 55,56 30,09 28,32 40,30 37,1 32,58 26,5 32,58 42,28 54,77 41,09 30,03 33,19 48,09 35,38 35,2 26,91 36,25 41,02 42,73 34,3 34,12 39,98 36,76 29,91 30,03 42,73 32,58 53,03 33,75 33,57 26,5 42,4 52,71 39,7 39,7 31,46 36,38 47,83 34,71 56,15 17,67 40,29 33,75 56,54 38,14 29,25 40,67 26,5 47,74 50,59 26,56 23,7 53,03 47,83 31,85 38,91 37,81 42,48 57,03 44,2 30,03 44,7 46,64 46,38 39,23 19,43 40,98 42,44 40,64 44,49 30,86 32 22,86 59,78 44,2 26,5 30,09 34,3 65,39 43,31 Média 29,25 34,87 40,62 45,37 43,91 Desvio Padrão 6,53 5,62 9,49 9,42 9,55
Tabela 6.2: A tabela, demonstra as 4 medidas em micrômetro refrentes a espessura da epi- derme com os vlores de cada grupo juntamente com a média e desvio padrão de cada uma. GI(Placebo),GII(0.5W/cm2), GIII(1.0W/cm2), GIV(1.5W/cm2) e GV(2.0W/cm2).