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A região codificadora da isoforma SfL-1 foi sintetizada no vetor pET28a, utilizada para a tranformação em células E. coli DH5α e estocadas em glicerol 20 % no freezer para uma eventual recuperação do DNA plasmidial caso necessário. Para a expressão e purificação da lectina recombinante com cauda de histidina, o gene sintético foi transformado em células de

E. coli BL21 (DE3). Testes de expressão foram realizados para se ter o melhor rendimento da

rSfL-1 na forma solúvel, como a variação de IPTG, temperatura e clones, e durante os teste foram retiradas aliquotas para análise da expressão em SDS-PAGE 12%. O teste de IPTG mostrou que a proteína de fusão (~30 kDa) pode ser produzida a uma concetração de 0,05 mM, mas de forma insolúvel a 37º C por 4 horas em agitação constante (FIGURA 29).

Figura 29 – Teste de expressão com variação de IPTG.

Fonte: Elaborado pela autora. SDS PAGE 12% da indução da rSfL-1 a 37º C por 4 horas com variação de IPTG. M – Marcador MW-SDS-70L; 1 e 2 – Indução com IPTG 0,05 mM fração insolúvel e solúvel; 3 e 4 - Indução com IPTG 0,1 mM fração insolúvel e solúvel; 5 e 6 – Indução com IPTG 0,5 mM fração insolúvel e solúvel; 7 e 8 – Indução com IPTG 1,0 mM fração insolúvel e solúvel.

Após identificar a melhor concentração de IPTG para as induções foram feitos testes para encontrar a melhor condição de expressão da recombinante na forma solúvel. A indução em várias temperaturas mostrou que tanto a 25º C por 20 horas ou 18º C por 24 horas sob agitação contante a rSfL-1 se apresenta tanto na forma solúvel quanto insolúvel (FIGURA 30). A condição de 25º C foi escolhida por apresentar visualmente uma maior concentração da recombinante na forma solúvel.

Figura 30 – Teste de expressão com variação de temperatura.

Fonte: Elaborado pela autora. SDS PAGE 12% da Indução com IPTG 0,05 mM. M – Marcador MW-SDS-70L; 1 e 2 – Fração insolúvel e solúvel no tempo 0 horas da indução; 3 e 4 - Fração insolúvel e solúvel da indução a 37º C por 4 horas; 5 e 6 – Fração insolúvel e solúvel da indução a 30º C por 16 horas; 7 e 8 – Fração insolúvel e solúvel da indução a 25º C por 20 horas; 9 e 10 – Fração insolúvel e solúvel da indução a 14º C por 24 horas.

Por fim, foi avaliado a diferença de expresão entre os clones transfomados (FIGURA 31). Não foi observado uma diferença significativa na expressão entre os clones e foi selecionado o clone 1 para os experimentos de produção da lectina recombinante.

Figura 31 – Teste de expressão com diferentes clones.

Fonte: Elaborado pela autora. SDS PAGE 12% da Indução com IPTG 0,05 mM a 25º C por 20 horas. M – Marcador MW-SDS-70L; 1 – Indução no tempo 0 horas; 2 e 3 - Fração insolúvel e solúvel do clone 01; 4 e 5 – Fração insolúvel e solúvel do clone 02; 6 e 7 – Fração insolúvel e solúvel do clone 03; 8 e 9 – Fração insolúvel e solúvel do clone 04.

A proteina recombinante foi obtida de forma sóluvel a partir de um lisado de células de 250 mL de indução e purificada em um único passo cromatográfico em coluna de afinidade de níquel (HisTrap FF Crude) com eluição em tampão TBS contendo 150 mM de imidazol (FIGURA 32) com rendimento de aproximadamente 60 mg por litro de indução.

Figura 32 – Purificação da rSfL-1 em coluna de HisTrap.

Fonte: Elaborado pela autora. Purificação da rSfL-1 em coluna HisTrap FF Crude. P1 – Pico não retido sendo lavado com tampão Tris-HCl pH8,0 contendo NaCl 150 mM, imidazol 20 mM e glicerol 10%; P2 – Pico retido sendo eluído com tampão Tris-HCl pH8,0 contendo NaCl 150 mM, imidazol 150 mM e glicerol 10%; Seta indica o momento da troca de tampão para eluição da recombinante.

O P2 da cromatografia de HisTrap apresentou atividade hemaglutinante contra eritrócitos de coelho tratados com tripsina, sendo inibida por manana de levedura a uma concentração mínima de 31,25 µg.mL-1_{. Assim, a rSfL-1 se apresenta ativa e com a mesma} especificidade de ligação que a SfL.

A rSfL-1 foi eficientemente purificada por único passo cromatografico em coluna de afinidade a níquel, como pode ser visto na eletroforese de SDS-PAGE na Figura 33.

Figura 33 – Expressão e purificação da rSfL-1.

Fonte: Elaborado pela autora. SDS PAGE 12% da indução, da purificação em cromatografia HisTrap e da SfL nativa. 1 – Fração insolúvel, 2 – Fração solúvel, 3 – P1 da HisTrap, 4 – P2 Histrap, 5 – SfL nativa e M – Marcador Sigma Marker Low Range.

A rSfL-1 apresentou um rendimento 60 mg por litro de cultivo e indução com baixa concentração de IPTG (0,05 mM). Uma cromatografia de exclusão molecular foi realizada para avaliar a pureza da lectina recombinante (FIGURA 34).

Figura 34 – Cromatografia de exclusão molecular da rSfL-1.

Fonte: Elaborado pela autora. Perfil cromatográfico da rSfL-1 em cromatografia de exclusão molecular na coluna BioSuite SEC acoplado em sistema Acquity UPLC.

A rSfL-1 apresentou um tempo de retenção de de 25,7 minutos com massa calculada de 26,8 kDa e um segundo pico aos 27,9 minutos com massa de 18,7 kDa. O perfíl cromatográfico foi parecido com a da SfL, que também apresentou dois picos, sendo o segundo acompanhado por um arrastado, mas com massas calculadas maiores para ambos os picos, 30 e 22 kDa. Os picos da exclusão molecular foram avaliados em SDS-PAGE junto com o P2 da HisTrap e a SfL nativa, e mostrou ser a lectina rSfL-1 em ambos os picos da cromatografia na coluna BioSuite (FIGURA 35).

Figura 35 – Expressão e purificação da rSfL-1.

Fonte: Elaborado pela autora. SDS PAGE 12% da cromatografia em BioSuite com o P2 da HisTrap e a SfL nativa. 1 – P2 Histrap 2 – P1 BioSuite, 3 – P2 BioSuite, 4 – SfL nativa, M – Marcador Sigma Marker Low Range.

Outras lectinas de algas da mesma família foram produzidas de forma semelhante, como a rOAA e a rKAA-1 com rendimentode 48 mg e 115 mg por litro de indução, respectivamente. Ambas foram purificada em um único passo cromatografico em coluna de níquel imobilizado (SATO; HORI, 2009; HIRAYAMA et al., 2016).

Como a rOAA e a rKAA-1, a rSfL-1 foi purificada em um único passo cromatográfico em coluna de níquel imobilizado com ótimo rendimento (60 mg.L-1_{). A rSfL-1} purificada por HisTrap foi utilizada nos demais experimentos de dicroismo circular, cristalização e avaliação do potencial biotecnológico.