A identificação dos osteoclastos, mesmo quando estão em processo de reabsorção óssea ativa, é uma tarefa difícil, tendo em conta que estas células são
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raras no osso normal e estão frequentemente ausentes no osso com remodelação diminuída.
Por estes motivos, a superfície osteoclástica e a contagem de osteoclastos (por unidade de superfície ou de volume) podem ser facilmente subavaliadas, por um observador menos experiente em histomorfometria óssea.
Recentemente, numa investigação integrada no projeto - “KDIGO- diagnóstico invasivo da osteodistrofia renal”- a que já nos referimos anteriormente, tivemos a oportunidade de comparar os resultados histomorfométricos, da leitura duma amostragem das mesmas lâminas, que rodaram por cada um dos 5 centros internacionais envolvidos. Numa avaliação preliminar (resultados ainda não publicados), pudemos confirmar que as contagens de osteoclastos e a quantificação da superfície de reabsorção foram os parâmetros estáticos que apresentaram maior variabilidade inter-centro.
Tendo em conta que o processo de remodelação óssea resulta do emparelhamento e da continuidade entre a reabsorção e a formação, parece-nos fundamental caracterizar ambas as fases deste ciclo.
Os osteoclastos multinucleados resultam da fusão de precursores mononucleados derivados de unidades formadoras de colónias de granulócitos- macrófagos, de origem na medula óssea, sob a ação de estímulos locais e sistémicos, muitos deles dependentes dos osteoblastos e da matriz óssea envolvente.
Estas células ativadas são o mediador final da reabsorção óssea, efetuada após o reconhecimento da matriz óssea pela integrina V3, na qual participam
enzimas libertadas pelos próprios osteoclastos, como a fosfatase ácida e a catapesina.
De salientar que, como discutiremos no capítulo 5 a propósito das nossas investigações nesta área, no quadro urémico encontram-se níveis séricos aumentados de diversas citoquinas envolvidas na remodelação óssea (nomeadamente interleucina 1, interleucina 2, interleucina 6 e interleucina 11) (87) (88) e ainda aumento dos respetivos recetores solúveis ou antagonistas (64) (89), o que parece ter um papel relevante na etiopatogénese da ODR urémica.
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Habitualmente, a doença óssea de baixa remodelação, (na qual, como discutimos anteriormente, devem ser incluídas a doença adinâmica e a osteomalácia), cursa com acentuada redução da ativação das células, envolvidas na formação e na reabsorção óssea.
Nestes quadros, é frequente não conseguirmos identificar quaisquer osteoclastos em processo de reabsorção óssea ativa. Também a superfície osteoblástica está habitualmente muito deprimida, quando comparada com os intervalos da normalidade.
No entanto, existem patologias, mesmo com baixa remodelação, que cursam aparentemente com osteoclasia, isto é, com aumento da atividade osteoclástica (às quais já fizemos referência no capítulo 4.1) (76).
Estes quadros resultam, frequentemente, de evoluções entre diferentes tipos de osteodistrofia, em resposta à terapêutica instituída (de causa iatrogénica). Como já referimos, e à semelhança do defendido pelos nossos colegas brasileiros (77) entendemos que estas observações correspondem a estados de transição e não a uma nova classe diagnóstica da osteodistrofia renal.
Não podemos esquecer que a histologia óssea de osso não descalcificado, no doente urémico, representa uma fotografia, obtida em determinado momento, da evolução da doença.
Nestas circunstâncias, a doença adinâmica com osteoclasia pode resultar da melhoria significativa da doença adinâmica (o que raramente ocorre) ou, pelo contrário, e mais frequentemente, da evolução da doença de elevada remodelação para doença adinâmica (fruto do “excesso” de intervenção terapêutica) (77) (52).
Mas, não é apenas nos quadros de baixa remodelação, que é relevante identificar e eventualmente quantificar os osteoclastos e a superfície osteoclástica.
Também na doença óssea de elevada remodelação é relevante a identificação dos osteoclastos, bem como a caracterização das zonas de predomínio destas células, no osso trabecular ou no osso cortical (52).
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Estas diferentes distribuições da reabsorção óssea (cortical versus trabecular) vão condicionar, por exemplo, diferentes riscos de fratura óssea.
Conscientes da importância da identificação dos osteoclastos e da relevância da avaliação da reabsorção óssea, resolvemos realizar por rotina, desde a primeira biopsia, em todos os nossos exames, a coloração específica pela fosfatase ácida, que aprendemos em Paris, no Hôpital Lariboisière, com a Professora Marie Christine de Vernejoul e com a técnica Caroline Morieux (90).
A fosfatase ácida resistente ao ácido tartárico (TRACP) é uma proteína catiónica, presente nos osteoclastos, nos macrófagos e em células dendríticas. Os osteoclastos ativados expressam TRACP nas suas vesículas intracelulares (preenchidas por produtos de fagocitose resultantes da degradação óssea) e libertam esta enzima para a zona de reabsorção óssea ativa.
A TRACP é uma metaloproteína que tem a capacidade de catalisar a síntese de radicais de oxigénio, os quais destroem as ligações peptídicas das proteínas da matriz óssea (91) (92), com particular relevância na degradação do colagénio tipo I (93).
Paralelamente, a TRAP induz a desfosforilação de fosfoproteínas ósseas como a osteopontina, amplificando desse modo a capacidade de degradação do tecido ósseo (94).
Curiosamente, visto a osteopontina ser responsável pela ancoragem dos osteoclastos à superfície de reabsorção, a degradação desta proteína pela TRACP, poderá constituir um mecanismo relevante de regulação e autolimitação da reabsorção óssea.
As condições físicas associadas ao método histoquímico para evidenciar a atividade da TRACP nas biopsias ósseas, são particularmente relevantes, visto estarmos em presença duma proteína termo lábil (95) (96).
Por este motivo, e conscientes da necessidade de padronizar o nosso método de deteção dos osteoclastos ativados, resolvemos tentar otimizar o método histoquímico de coloração pela TRACP.
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Selecionámos os fragmentos ósseos de 10 doentes com hiperparatiroidismo secundário severo (já confirmado aquando da avaliação de rotina das lâminas ósseas) e obtivemos múltiplas secções de 5 µm.
Efetuámos o método histoquímico para identificar a presença de TRACP, durante o tempo fixo de 30 minutos, mas a diferentes temperaturas: 37º, 45º, 60º, 70º e 80ºC.
Ao contrário do que era descrito na literatura, identificámos a temperatura de 60ºC como aquela que permite otimizar a coloração dos osteoclastos pela TRACP, permitindo o máximo de contraste (surgindo os osteoclastos ativos corados de vermelho vivo) e facilitando a identificação destas células.
As temperaturas superiores a 70ºC induzem, frequentemente, a perda da secção óssea (que se descola da lâmina de vidro), o aparecimento de múltiplos artefactos intracelulares, bem como a rutura e perda de integridade dos osteoclastos.
Por este motivo não devem ser utilizadas temperaturas superiores a 60ºC. Pelo contrário, temperaturas da reação inferiores a este valor, conduzem a uma coloração ténue de muitos osteoclastos, dificultando a sua identificação e impossibilitando a utilização de métodos histomorfométricos automatizados.
A otimização e padronização da coloração pela TRACP, como resultado desta nossa investigação, passou a permitir a contagem, (de forma consistente e sem grande variabilidade inter-observador), do número de osteoclastos e da superfície osteoclástica, por método automático (mediante o recurso a qualquer dispositivo histomorfométrico com separações por cores).