Atualmente, nanopartículas vem sendo empregadas como suportes de enzimas (HEGEDUS; NAGY, 2009; JIA et al., 2003). O uso de nanobiocatalisadores, com a combinação de nanotecnologia e biotecnologia, vem sendo considerado uma das áreas promissoras nos diferentes campos da ciência. Nanopartículas magnéticas (MNPs – “magnetic nanoparticles”) representam uma classe de nanopartículas (< 100 nm) que podem ser manipuladas sob a influência de um campo externo magnético. MNPs são comumente compostas de elementos magnéticos, tais como: ferro, níquel, cobalto e seus óxidos (SHUBAYEV et al., 2009).
Dentre as nanopartículas magnéticas estudadas, as constituídas por óxidos de ferro (Fe2O3
e Fe3O4) têm atraído maior interesse tecnológico, especialmente em aplicações onde se requer
nanopartículas estáveis com tamanhos e formas uniformes, além de bem dispersas quimicamente (MEDEIROS et al., 2011).
A forma e a estrutura das MNPs variam consideravelmente com o método utilizado. Atualmente, algumas pesquisas vêm avaliando a influência da forma das MNPs em sistemas biológicos. Por exemplo, Park e colaboradores (2008) utilizaram nanopartículas de formato alongado de dextrana recobertas com óxido de ferro em sistemas in vivo (tempo de circulação dos MNPs = 48 horas). De acordo com os resultados obtidos, o tumor alvo reduziu de tamanho consideravelmente com o uso desse sistema. Quando utilizado outro tipo de formato e sob as mesmas condições, não foi observada a mesma eficiência. A química de superfície é outro fator determinante crítico que regula as propriedades físico-químicas das MNPs, incluindo o tamanho, solubilidade, estado de dispersão e valores de magnetização. Além disso, é de fundamental importância o entendimento dos mecanismos de reconhecimento celular, biodistribuição e
“resposta imune” (GUPTA, et al., 2007). A avaliação desses parâmetros representa um avanço em encontrar estratégias para diminuir o potencial de nanotoxicidade.
Xin e colaboradores (2010) propuseram o uso de nanopartículas magnéticas de óxido de ferro ( -Fe2O3/Fe3O4) como suporte de imobilização para proteases (papaína e termolisina), com
Fabio Pereira Fagundes
o intuito de obter oligopeptídeos em meio orgânico. Os resultados comprovaram a eficiência desse sistema, com altos de índices de conversão após 5 reusos. Além disso, as enzimas imobilizadas nesse tipo de suporte apresentaram excelente estabilidade em diferentes pHs e temperaturas. Esse tipo de sistema tem chamado bastante atenção devido a algumas particularidades, tais como: tamanho de partícula e superfície controlável, larga área superficial,
fácil recuperação e por não apresentar problemas de difusão. Nos últimos 20 anos, nanopartículas revestidas de sílica têm atraído bastante atenção para
aplicação em catálise, separação, biosensores e adsorção. A sílica é frequentemente empregada como material de revestimento da superfície de nanopartículas. Existem várias propriedades que as tornam materiais especiais para a nanotecnonolgia, como, por exemplo, o tamanho da partícula, que pode ser ajustado de 5 a 30 nm, assim como sua porosidade, que pode variar entre 2 e 10 nm, apresentando uma excelente estabilidade e rigidez, propriedades que permitem a resistência ao estresse mecânico e à degradação. Além disso, a sílica é responsável pelo aumento da hidrofilicidade das nanopartículas magnéticas, fato esse, que a torna um importante material para uso na imobilização de enzimas. De acordo com a Figura 13, pode-se observar uma superfície de nanopartículas revestidas com sílica usada para imobilização.
Figura 13 – Superfície de nanopartículas de ferro revestidas com sílica
Fonte: Dios; Díaz-García, 2010
A Figura 13 mostra os grupos hidroxila das nanopartículas magnéticas de ferro reagindo com os grupos alcóxi das moléculas de silano levando à formação de ligações Si-O e permitindo a imobilização de outras moléculas ligadas aos grupos funcionais terminais.
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Sustrova e colaboradores (2009) usaram nanopartículas magnéticas modificadas com o polissacarídeo agarose para a imobilização da quimotripsina no uso da clivagem proteolítica da pepsina porcine A. Essa imobilização resultou em um aumento da atividade catalítica em diferentes pHs (7,2 – 8,7) e maior estabilidade térmica em diferentes temperaturas (25 – 70 oC), quando comparados à protease livre, além de um alto número de ciclos de reutilização (> 12). Resultados similares foram descritos previamente por Hong e colaboradores (2007).
Jin e colaboradores (2010) sintetizaram um suporte para imobilização de um tipo de protease alcalina baseado em nanopartículas magnéticas modificadas com trietoxisilano, com diâmetro médio em torno de 25 nm. Esse sistema protease/suporte foi utilizado na hidrólise do óleo de canola. De acordo com os resultados obtidos nesse trabalho, esse sistema apresentou uma retenção de atividade catalítica superior a 98% em 60 dias de estocagem. Também foram observados índices relevantes de atividade hidrolítica usando caseína como substrato (48%), quando comparados à enzima livre.
Hong e colaboradores (2007) imobilizaram covalentemente α-quimotripsina em nanogéis
de poliacrilamida recobertos em sua superfície com Fe3O4, com diâmetro médio em torno de 10
nm. De acordo com os resultados de atividade hidrolítica, usando N-benzoyl-L-arginine ethyl ester (BAEE) como substrato, concluiu-se que esse sistema apresentou resultados satisfatórios de termoestabilidade, tempo de estocagem e reusabilidade.
Ming e colaboradores (2006) encapsularam a enzima horseradish-peroxidase em nanogel. A enzima encapsulada manteve 80 % de sua atividade mesmo após 90 minutos de incubação à temperatura de 65 ºC, enquanto o tempo de meia vida da enzima livre foi em torno de 10 minutos sob as mesmas condições. A enzima imobilizada na rede polimérica (nanogel) representa uma nova e promissora técnica para uso nas áreas de farmacologia e medicina (Kabanov & Vinogradov, 2008).
Hegedus & Nagy (2009) imobilizaram a protease α-quimotripsina utilizando uma das mais recentes técnicas de imobilização em sistemas nanoparticulados (SENs – Single enzyme nanoparticles), com tamanho da nanopartícula variando na faixa de 10 a 40 nm. Essa técnica é baseada no fato que cada molécula de enzima é revestida utilizando uma nano-rede polimérica, formada por uma monocamada fina e bastante porosa. Essa estrutura resulta em uma maior estabilidade da enzima sem qualquer limitação significante de transferência de massa do substrato da solução para o sítio ativo da enzima. Os resultados obtidos nesse trabalho indicaram
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que a α-quimotripsina imobilizada apresentou uma maior estabilidade em relação a sua forma
livre em toda faixa de temperatura e pH avaliada (Figura 14).
Figura 14 – Ilustração esquemática da combinação dos modelos clássicos para o surgimento de uma nova técnica aplicada para a imobilização de enzimas – SEN’s (SENs – Single enzyme nanoparticles). (a) – Suportes
metálicos; (a1) – Partículas nanomagnéticas; (b) – Reticulação de polímeros para a formação de nanogéis; (b1) Dendrímeros e (c) Single enzyme nanoparticle
Fonte: Adaptada de Hegedus & Nagy, 2009