A interleucina-3 é uma citocina importante na regulação da hematopoese, pois estimula a formação de colônias de uma variedade de linhagens hematopoéticas e, por este motivo, é também denominada “multi-lineage colony stimulating factor” (multi-CSF) (Celestin et al., 2001). Ela é capaz de estimular a diferenciação das CTHs em progentiores mielóides, assim como pode estimular a proliferação de todas as células da linhagem mielóide (Yang, 1986; Peschon, et al., 1994).
A IL-3 liga-se à cadeia especifíca para IL-3, sendo a cadeia comum para alguns membros desta família de citocinas (tipo I) em humanos (GM-CSF e
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IL-5), enquanto que em camundongos, a cadeia do receptor de IL-3 é específica para a cadeia (Geijsen et al., 2001). A dimerização, entre as cadeias e resulta no desencadeamento de vias intracelulares que produzem efeitos específicos (Fig. 9).
Tem sido descrito que a ligação da IL-3 no seu receptor ativa preferencialmente a JAK-2, a ERK1/2, e a STAT-5 em células humanas CD34+ (Irish et al., 2004), além da PLC2, da PKC e da Ca2+ calmodulina cinase II (CaMKII) em camundongos (Paredes-Gamero et al., 2008; Leon et al., 2009 – Submetido).
Em células da linhagem FDB, as quais foram alteradas para gerar mutantes ativos para os receptores da IL-3, foi observado que a ativação da IL-3 induz proliferação celular (McCormack & Gonda, 2000). Na linhagem leucêmica “multipotent murine stem cell line” (FDCP-mix) a IL-3 promove a auto-renovação celular (Just et al., 1991). Em culturas de Tersaki, a ação da IL-3 promove proliferação e maturação das CTHs (Domen & Weissman, 2000).
A IL-3 parece produzir seus efeitos pela ativação da PKC visto que os inibidores da PKC foram capazes de inibir parcialmente a proliferação celular dependente de IL-3. Além disso, IL-3 ativou a PKC nas áreas proliferativas das culturas de medula óssea de longa duração (Paredes-Gamero et al., 2008). A participação da PKC no processo de diferenciação de células hematopoéticas precursoras também foi mostrada por Rossi et al. (1996) onde o éster de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) produziu a formação de eosinófilos ou células mielóides dependendo da concentração utilizada. Ademais, foi mostrado que a IL- 3 é capaz de promover a proliferação da linhagem FDCP-Mix1, o aumento da [Ca2+]i e a ativação da PKC (Whetton et al., 1988).
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Figura 9: Modelo da via de sinalização da IL-3. A presença do ligante induz a associação das
cadeias e formando um complexo heterodimérico. A ativação do receptor recruta principalmente a JAK2 para a cadeia do receptor na sua porção citoplasmática. Ativação de JAK 2 leva à fosforilação do receptor em múltiplos resíduos de tirosina, os quais por sua vez servem de sítios de ligação para outras proteínas transdutoras de sinal, como as STATs. Outras proteínas requerem moléculas adaptadoras contendo domínios SH2, formando um complexo (SHIP, SHC, GRB2, SOS) junto à cadeia citoplasmática do receptor e ativando outras proteínas cinases, tais como a Ras/Raf/MEK/ERK1/2 (cuja cascata de sinalização culmina no aumento da expressão dos fatores de transcrição c-Jun e c-Fos) e a via da cinase lipídica PI3K, a qual sob estímulo de IL-3 recruta a Akt, a p70S6K (cinase S6 ribossomal p70) e as proteínas da família Bcl-2, Bcl-XL entre outras proteínas, modulando a sobrevivência celular. (Figura adaptada de: Qiagen (https://www1.qiagen.com/geneglobe/pathwayview.aspx?pathwayid=242).
23 2. OBJETIVO
O controle da hematopoese envolve um processo complexo, o qual pode ser modulado por vários compostos, dentre eles a vitamina E. Embora se saiba da influência da vitamina E na hematopoese, seus efeitos sobre componentes celulares específicos e os mecanismos moleculares pelos quais regula a hematopoese são pouco conhecidos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi determinar o papel do -tocoferol, principal componente da vitamina E, in vivo no controle da hematopoese murina, assim como os mecanismos intracelulares por ele modulados.
Para tal, foram analisados os seguintes parâmetros:
Determinação do efeito tóxico do -tocoferol nas células da medula óssea. Avaliação da proliferação celular por análise histológica, pela formação de
unidades formadoras de colônias e pela análise do ciclo celular.
Imunofenotipagem para quantificação das células em cada uma das principais populações hematopoéticas: população de células- tronco/progenitoras hematopoéticas (CTPHs), população de células progenitoras linfóides e mielóides (CPLMs) e as populações de células maduras (eritróides, mielóides e linfóides).
Análise da ativação de proteínas de vias de sinalização (p-ERK1/2, p-PKC, p-STAT-5 e p-Akt) envolvidas no controle da hematopoese.
Avaliação da ativação da ERK1/2 e STAT-5 pelo estímulo com IL-3.
24 3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Materiais
3.1.1. Drogas e Reagentes
Dos seguintes fabricantes foram adquiridos os seguintes produtos:
Calbiochem (Darmstadt, Alemanha): 2-hidroxipropil- -ciclodextrina (PD98059) e óleo de imersão.
Cell Signaling Technology (CA, EUA): Anticorpos contra caspase-3 clivada, fosfo-PKCpan [Ser660], fosfo-Akt [Thr308], fosfo-ERK1/2 [Thr202/Tyr204,Thr185/Tyr187] e fosfo-STAT-5 [Tyr694].
Cultilab (Campinas, Brasil): Soro fetal bovino (SFB).
Electron Microscopy Science (PA, EUA): Paraformaldeído.
Invitrogen Life Technologies / Molecular Probes (CA, EUA): 2',7'-dicloro- fluoresceína diacetato (DCF-DA), anti-IgG de coelho e de cabra conjugados com Alexa Fluor 488, SYTO-Green e meio Dulbecco modificado por Iscove (IMDM).
Mantecorp (RJ, Brasil): Óleo mineral Nujol.
Merck (RJ, Brasil): Dimetilsulfóxido (DMSO), glicina, glicose e sais inorgânicos. Pharmingen Becton Dickinson (EUA): anticorpos contra c-Kit conjugado com
aloficocianina (APC), Sca-1 conjugado com ficoeritrina (PE), Mac-1 conjugado com PE, Gr-1 conjugado com ficoeritrina – ciano 7 (PE-Cy7), Gr-1 conjugado com fluorocianina isotiocianina (FITC), streptavidina (ST) conjugada com proteína peridinina clorofila (PerCP) e os anticorpos biotinilados contra CD3, Ter119, Gr-1, Mac-1 e B220, todos feitos em ratos, anexina V-FITC, solução “FACs Lysing”, triton X-100.
Sigma - Aldrich (MO, EUA): -tocoferol, saponina, iodeto de propídeo (PI), penicilina, estreptomicina, interleucina 3 (IL-3), eritropoietina (EPO), corante May-Grunwald-Giemsa (modificado por Rosenfeld), Azul de Tripan, albumina sérica bovina (BSA) e azida,
25 3.1.2. Soluções
3.1.2.1 Solução Tyrode
A solução Tyrode foi preparada momentos antes do experimento, a partir de 2 soluções concentradas (I e II ):
Solução I: 200g NaCl, 5g KCl, 5g CaCl2 H2O, 2,5 mg Cl2 6H2O Solução II: 2,5 mg NaH2PO4
A diluição foi feita acrescentando-se 40 mL da solução I e 20 mL da solução II em 500 mL de água Milli-Q. Depois de homogeneizar a solução, acrescentou-se 1 g de bicarbonato de sódio (Na+) e 1 g de glicose, completando- se o volume para um litro. O pH foi ajustado para 7,4 em pHmetro.
Composição final da solução Tyrode (mM): NaCl 137; KCl 2,7; CaCl2 1,36; MgCl2 0,5; NaH2PO4 0,36; NaHCO3 11,9; Glicose 5,5.
3.1.2.2. Solução salina tampão fosfato (PBS – “Phosphate buffer saline”)
A solução salina tampão fosfato (PBS) foi preparada utilizando-se água deionizada (Milli-Q) e o pH foi ajustado para 7,4 em pHmetro.
Composição da solução PBS (mM): NaCl 137; 2,7 mM KCl, KH2PO4 2; Na2HPO4 10.
3.1.2.3. Solução tampão para ligação de anexina coma fosfatidilserina
A solução tampão com Ca2+ elevado é necessária para a ligação da anexina-V com a fosfatidilserina de membrana. O pH foi ajustado para 7,4 em pHmetro.
Composição da solução (mM): NaCl 140; Hepes/NaOH 10; CaCl2 2,5.