III.1.1.1. Obtenção do antígeno solúvel de taquizoítas de N. caninum
O AgNc foi preparado a partir de taquizoítas derivados de cultivo celular. Os taquizoítas coletados foram lavados 2 vezes em PBS, por centrifugação a 600 x g, durante 10 minutos. O sedimento de parasitos foi ressuspenso em 1 ml de PBS estéril e submetido a 10 ciclos de congelamento a -80 ºC e descongelamento em banho-maria a 37 ºC. Logo após a suspensão foi centrifugada a 15000 x g durante 1 hora a 4 ºC. O sobrenadante foi coletado e a concentração de proteína determinada pelo kit “BCA Protein Assay”. O AgNc foi então armazenado em freezer -80ºC, em alíquotas de 100 ȝl até o momento do uso.
III.1.1.2. Estimulação de células de linfonodos poplíteos in vitro
Os linfonodos poplíteos dos cães do G1 e G2, além dos dois animais adultos controles, foram retirados por meio de ato cirúrgico aos 30 dpi, sendo os animais mantidos em analgesia e em condições assépticas. Após a excisão, uma parte dos linfonodos foi macerado em PBS estéril e centrifugado por 10 minutos, 600 x g, a 4oC. A seguir, o sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspendido em 10 ml de PBS estéril, e submetido à nova lavagem. A separação dos linfócitos foi realizada por meio de gradiente de densidade com Histopaque 1077, na proporção de 1:1 com PBS estéril, sendo centrifugados a 400 x g, por 30 minutos, a 4oC. A fração contendo os linfócitos foi retirada e aproximadamente 1 x 106células foram adicionados nos poços de uma placa de cultivo celular, que continham meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal bovino e submetidos a três tratamentos distintos: 1.) sem estímulo exógeno (Meio – controle negativo); 2.) estimulados com ConA (2,5 ȝg/ml), uma lectina que se apresenta como potente mitógeno de células T (controle positivo); e 3.) com adição de AgNc (25 ȝg/ml), para se observar as respostas antígeno-específicas. Os linfócitos foram cultivados por 72 horas, a 37oC, com injeção constante de 5% de CO2.
III.1.1.3. Determinação das subpopulações de linfócitos T no sangue periférico e linfonodos poplíteos
Foi utilizada a técnica de imunofluorescência direta para a tipificação e quantificação de linfócitos T CD4+ e CD8+ em sangue total e nos linfócitos extraídos dos linfonodos, por meio de ensaios de citometria de fluxo. Para a determinação sanguínea, duas alíquotas de 100µl de sangue periférico por animal foram colhidas com EDTA nos dias 0, 7, 10, 14, 21, 30, 45, 60, 75, 100, 140 e 200 dpi, sendo colocadas em tubos próprios para citometria de fluxo, logo após a colheita. Quanto aos linfócitos cultivados in vitro, 1x106 células/amostras/estímulo em duplicata foram lavadas duas vezes com PBS, para retirada do meio de cultura, e ressuspendidas em 100µl de PBS estéril. Uma das alíquotas foi incubada com 1µl do reagente comercial que consiste em dois anticorpos monoclonais: IgG2a de rato anti-CD4 canino (FITC) e IgG1 de rato anti- CD8 canino (PE). A outra alíquota serviu como controle isotípico negativo da reação, com a finalidade de eliminar fluorescências inespecíficas no momento da leitura. Os anticorpos monoclonais utilizados para esta finalidade foram IgG2a de rato anti-hapteno de dinitrofenil (FITC) e IgG1 de rato anti-hapteno de dinitrofenil (PE). A incubação dos anticorpos foi realizada durante 30 minutos a 4ºC. Em seguida, as amostras de sangue foram submetidas à lise de hemácias utilizando-se 2ml do tampão “FACS Lysing Solution” na diluição de uso, por 4 minutos à temperatura ambiente, na ausência de luz. Após verificação da lise das hemácias, adicionou-se 2ml de PBS e centrifugou-se os tubos a 300 x g por 10 minutos a 4ºC. As amostras advindas do cultivo celular não tiveram a necessidade de serem submetidas à hemólise. Após a centrifugação, o sobrenadante foi desprezado e o botão de células ressuspendido em 2 ml de PBS, para novo ciclo de centrifugação. O protocolo de lavagem das células marcadas foi realizado por quatro vezes para todos os ensaios, com o intuito de eliminar anticorpos não ligados. Após as lavagens, o botão de células foi ressuspendido em 300µl de PBS adicionado de 1% de formaldeído, para a conservação da reação até o momento de sua leitura, que foi realizada até 72 horas para que se obtenham resultados fidedignos. As preparações celulares foram analisadas em citômetro de fluxo (10.000 eventos por amostra). A seleção das subpopulações celulares encontradas nas diferentes amostras analisadas foi possível por meio de protocolos de aquisição pré-estabelecidos (BYRNE
et al., 2000). Brevemente, as células analisadas foram dispostas em um gráfico de tamanho por granulosidade, onde os linfócitos foram selecionados (Figura 22A), sendo possível assim analisar a marcação específica pelos fluorocromos FITC e PE, por meio do número de células marcadas em relação ao total adquirido (Porcentagem – Figura 22B) ou através da mediana do número de marcações fluorescentes por célula (Expressão – Figura 22C). Para se obter valores que associassem a porcentagem de células marcadas com a expressão dos marcadores analisados, foi estabelecido o Índice de produção de CD4+ e CD8+, onde se multiplicou os valores de porcentagem e expressão de cada amostra analisada. A análise das amostras foi realizada por meio de software e expressas por meio de média dos valores obtidos para cada grupo. As populações de células foram compensadas a fim de evitar a interferência do canal de fluorescência FITC no canal de fluorescência PE e vice-versa.
III.1.1.4. Índices de normalidade calculados para a porcentagem, expressão e Índice de produção de células T CD4+ e CD8+
A porcentagem, expressão e Índice de produção de linfócitos T CD4+ e CD8+ presentes na circulação sanguínea de animais não infectados foram determinados com a intenção de se estabelecer faixas de normalidade para os parâmetros analisados. Com este objetivo, foram realizadas 20 leituras dos grupos controles adultos e de filhotes. No grupo dos animais adultos controles, foram feitas 10 reações de citometria para cada animal, com amostras colhidas em datas diferentes. Quanto aos filhotes controles, realizaram-se duas reações em dias diferentes, de cada um dos 10 animais disponíveis. Com os valores obtidos em cada grupo, realizou-se uma média das 20 leituras para cada parâmetro, e obteve-se o desvio padrão. A faixa de normalidade foi estabelecida pelo intervalo entre a adição e subtração de um desvio padrão sobre a média obtida (Tabela 7).
III.1.2. Imunofenotipagem de células contidas em linfonodos poplíteos por