A completa desinfecção do sistema de canais radiculares pode ser considerada a principal razão do tratamento endodôntico de dentes com necrose pulpar. Estudos onde canais radiculares infectados foram instrumentados e irrigados apenas com solução salina demonstram que a instrumentação por si só proporciona apenas uma redução do número de microrganismos, sendo necessário o uso de soluções desinfetantes associadas à instrumentação para que um maior percentual de microrganismos seja eliminado16,28,100,104. No entanto, mesmo após a
limpeza e a modelagem dos canais radiculares, por meio da instrumentação e do uso de soluções irrigadoras de ação desinfetante, a eliminação total das bactérias viáveis dificilmente é obtida15-17,105,137.
As dificuldades referentes à completa desinfecção dos canais radiculares pelos protocolos de tratamento disponíveis até o momento estimulam a pesquisa endodôntica a buscar medicamentos e técnicas que permitam que o objetivo de completa desinfecção seja alcançado. Com freqüência, novas substâncias chegam ao mercado, e o conhecimento das propriedades físico-quimicas e biológicas das mesmas é essencial antes da sua aplicação na prática clínica.
O objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento das soluções Tetraclean® e MTAD® sobre a cepa de E. faecalis (VP3-181) e
frente ao biofilme. Estas soluções representam uma nova tendência da Endodontia, da utilização de substâncias associadas e com suposta ação sinérgica. Desta forma, teoricamente, se tem a soma de propriedades das diferentes substâncias, com economia de tempo e facilidade de aplicação. Tanto o MTAD® quanto o Tetraclean® são uma associação de antibiótico
(doxiciclina), detergente e ácido cítrico. As principais diferenças entre as duas substâncias são a concentração de doxiciclina e os diferentes detergentes utilizados. A cetramida a 0,2% está presente na composição do Tetraclean®e Tween 80 a 0,5% na fórmula do MTAD®.
Estudos têm atribuído a ação antimicrobiana das soluções MTAD® e Tetraclean® à doxiciclina, um isômero da tetraciclina45,47,129,156.
No entanto, sabe-se que a doxiciclina apresenta ação bacteriostática e não bactericida, e que algumas espécies bacterianas possuem resistência às tetraciclinas96,97,172. Sendo assim, o uso de antibióticos, na composição
de soluções irrigadoras e medicamentos para uso local durante o tratamento endodôntico, é questionável.
Após os primeiros testes piloto realizados anteriormente a este estudo, verificamos uma significante diferença na ação do Tetraclean® e do MTAD®. Enquanto o Tetraclean® induziu culturas
negativas já após 30 segundos de contato com a suspensão de Enterococcus faecalis, para o MTAD® foram necessários 10 minutos para a obtenção de culturas negativas.
Uma vez que a concentração de doxiciclina no Tetraclean®é
de 1%, e no MTAD® é de 3%, esta maior atividade antibacteriana do Tetraclean® sobre o E. faecalis não podia ser atribuída à doxiciclina.
Foram realizadas, portanto, alterações na formulação dos dois produtos. Em uma delas, a cetramida, detergente presente na formulação do Tetraclean®, foi adicionada ao MTAD®. Em outra combinação, o Tween
cetramida. As concentrações de cetramida utilizadas nas soluções foram escolhidas com base em testes piloto para identificação do potencial antibacteriano da mesma.
A avaliação da atividade antimicrobiana de substâncias utilizadas em Odontologia pode ser realizada por meio de diversos métodos, entre eles, o método de contato direto. Neste teste, inicialmente microrganismos são subcultivados em meios sólidos e após 12-24 horas, células bacterianas são suspensas, preferencialmente em água filtrada e esterilizada e a concentração da suspensão ajustada para a concentração celular desejada para o teste. A suspensão bacteriana é colocada em contato com as substâncias avaliadas pelos períodos de tempo pré- determinados, e decorridos estes tempos, alíquotas do material são retiradas. Se o objetivo for a avaliação qualitativa pela presença de turbidez, indicativa do crescimento bacteriano, alíquotas da mistura dos microrganismos com as soluções avaliadas serão incubadas em meio líquido; se a análise for quantitativa, o material deve ser diluído e alíquotas destas diluições são levadas a placas de meio ágar, incubadas e o número de UFC calculado136.
A metodologia de difusão em ágar de disco ou de gota, apesar de ainda muito utilizada, tem pouco valor ou até mesmo valor nulo para a mensuração da atividade antimicrobiana de desinfetantes. Este método foi desenvolvido para a mensuração da sensibilidade de determinadas cepas bacterianas a antibióticos sistêmicos, onde o diâmetro de inibição na placa de ágar corresponde a um efeito in vivo já documentado, com uma concentração da medicação conhecida no soro humano52.
O teste de contato direto, apesar de não reproduzir completamente as condições encontradas em infecções endodônticas, nos fornece subsídios para a comparação entre diferentes substâncias,
sem que haja fatores extrínsecos que poderiam limitar ou aumentar a ação antimicrobiana dos mesmos. Em testes in vivo ou ex vivo, sabe-se que o irrigante, para alcançar os microrganismos, precisa se difundir por istmos, ramificações do canal radicular e túbulos dentinários, e desta forma pode ser diluído em exsudatos e fluidos presentes no sistema de canais radiculares. Os canais radiculares apresentam uma mistura complexa de componentes orgânicos e inorgânicos, e estudos de Haapasalo et al.54 (2000) e Portenier et al.112,113 (2001, 2002) têm demonstrado que diferentes componentes como dentina, colágeno, proteínas e até mesmo células mortas apresentam efeito inibitório da ação antibacteriana de medicamentos e desinfetantes comumente utilizados no tratamento endodôntico. Torna-se importante portanto, considerar estes fatores durante os testes antibacterianos in vitro, já que estes podem gerar resultados errôneos a respeito da atividade antibacteriana de diferentes soluções e medicamentos.
O preparo da suspensão bacteriana também deve observar este princípio, e em decorrência disto, no presente estudo a suspensão de E. faecalis foi preparada em água filtrada e esterilizada. A suspensão das bactérias em meio de cultura antes do contato com os agentes antibacterianos poderia ocasionar a inibição parcial do seu efeito, uma vez que os meios de cultura possuem proteínas e outras substâncias orgânicas, com um efeito muitas vezes desconhecido sobre os desinfetantes avaliados.
A diluição em água filtrada e esterilizada, ou água mineral esterilizada manteve o número de colônias estáveis por até 48 horas, justificando seu uso para o preparo das suspensões e para as diluições decimais seriadas. Em testes piloto, foi verificado o crescimento de microrganismos quando suspensos em água filtrada e esterilizada após diferentes períodos de incubação. Este teste foi realizado uma vez que o diluente ideal deve manter estável o número de células bacterianas
viáveis por um período de até 48 horas. Somente desta forma, teremos certeza que a redução do número de colônias após os testes são decorrentes da ação antibacteriana das soluções irrigadoras, e não devido à ação de outros produtos. É importante salientar, que a água filtrada e esterilizada varia muito em sua composição dependendo da sua origem e portanto, testes prévios para se verificar a manutenção da viabilidade celular na água são sempre indicados.
Nos testes de contato direto foi utilizada uma cepa de Enterococcus faecalis (VP3-181) isolada de canais radiculares com infecção endodôntica persistente106. O E. faecalis é um microrganismo anaeróbio facultativo, facilmente cultivado, de alta relevância clínica e com capacidade de se estabelecer e sobreviver na ausência de outras bactérias e sobre stress. A escolha do E. faecalis ocorreu uma vez que este é um microrganismo comumente isolado em infecções endodônticas resistentes ao tratamento endodôntico85,106,108,119,135,138. O E. faecalis é é isolado com freqüência em culturas puras, em casos de dentes com necrose pulpar e lesão periapical persistente105,148. Além disso, diversos estudos têm demonstrado a resistência do E. faecalis ao hidróxido de cálcio, tanto in vivo quanto in vitro17,51,99,109, além de maior resistência que
outras espécies a agentes antibacterianos como o hipoclorito de sódio115,162.
A suspensão de E. faecalis foi preparada sempre a partir de subculturas deste microrganismo incubadas por 12 a 24 horas antes da realização dos testes, quando as células bacterianas se encontram na fase estacionária110. Esta padronização das condições experimentais é
essencial para facilitar a comparação entre diferentes estudos, já que o estado fisiológico do microrganismo avaliado terá efeito no resultado do tratamento antibacteriano. Bactérias na fase exponencial são as mais sensíveis110, enquanto as células em fase de espera são mais resistentes
aos diferentes tipos de estresse que células na fase exponencial e na fase estacionária44,74.
Outro cuidado observado durante a metodologia de contato direto foi o uso de uma substância com poder neutralizante da ação antibacteriana das soluções avaliadas. Substâncias neutralizantes ou inativadoras são freqüentemente utilizadas durante a avaliação de agentes antibacterianos, antisépticos e desinfetantes, e também na preservação da eficácia de diversos produtos farmacêuticos. A substância neutralizante ideal deve ser capaz de inativar completamente o efeito bactericida ou bacteriostático residual do agente antibacteriano evitando o carry-over durante o período de incubação, mas também deve ser uma substância sem nenhum efeito antibacteriano sobre os microrganismos avaliados131. Durante a execução do experimento, foi verificado o efeito
carry-over das soluções em testes onde alíquotas de uma suspensão de E. faecalis foram adicionados ao meio de cultura, posteriormente às diluições e à transferência da mistura contendo suspensão bacteriana e as soluções avaliadas. Nestes testes, em alguns tubos foi verificada a ausência de crescimento bacteriano, indicando, portanto, que havia ainda efeito antibacteriano residual das soluções.
Constatado o efeito carry-over, uma solução comprovadamente inativadora do efeito antibacteriano da clorexidina, à base de Tween 80 a 3% e a-lecitina a 0,3% preconizada por Zamany, Spangberg171 (2002) foi avaliada para neutralizar as soluções por nós utilizadas. Nos testes onde as diluições decimais seriadas foram primeiramente realizadas na solução neutralizante acima descrita, e onde foram utilizadas alíquotas adicionais de suspensão bacteriana acrescentadas diretamente no meio de cultura, foi verificado o crescimento de E. faecalis, o que confirmou que o efeito antibacteriano das soluções havia sido interrompido pelo neutralizante.
Os testes antibacterianos de contato direto quando realizados sem o uso de uma solução neutralizante, podem fornecer resultados falso negativos, já que os tempos experimentais nestes casos, não refletem o verdadeiro tempo de ação das substâncias avaliadas, que continuam agindo sobre os microrganismos, até sua saturação.
O modo de crescimento bacteriano tem efeito direto na resistência aos agentes avaliados e as metodologias que utilizam bactérias na forma planctônica não refletem completamente as condições de crescimento in vivo, onde os microrganismos se desenvolvem organizados em biofilme, e parecem ser mais resistentes a agentes bactericidas e bacteriostáticos21,35,37,97,123.
Diversos estudos utilizando o biofilme para avaliação de agentes antibacterianos foram publicados nos últimos anos21,34,35,37,47,101,123,126,161. No entanto, é importante observamos a
variedade de métodos empregados, onde muitas vezes o biofilme é incubado por poucos dias, e talvez não represente ainda um biofilme maduro, com as características de maior resistência do que células planctônicas tão comentadas.
Costerton et al.24 (1987) descreveram que a forma de
existência bacteriana em biofilme constitui o maior componente da biomassa bacteriana em muitos meios, e posteriormente, estes mesmos autores observaram que essas bactérias imóveis eram bastante organizadas22. O biofilme bacteriano pode ser definido como uma
comunidade estruturada de células bacterianas envolvidas em uma matriz extracelular de polissacarídeos, sempre aderida a um substrato sólido úmido ou meio líquido da qual eles podem retirar seus nutrientes, constituindo uma forma de proteção ao desenvolvimento bacteriano22,24,30,114,169. A associação bacteriana de múltiplas espécies, a
resistência, e sua matriz de exopolissacarideo impede a difusão das substâncias químicas para o interior das colônias bacterianas, impedindo assim o contato direto das substâncias químicas auxiliares com os microrganismos144,162. A complexa morfologia e fisiologia do biofilme, e
sua maior resistência aos agentes antibacterianos justificam seu uso como modelo in vitro para avaliação de soluções e medicamentos utilizados em Endodontia.
Para identificação e caracterização do biofilme, várias metodologias têm sido aplicadas, entre elas, a microscopia eletrônica de varredura e microscopia Confocal.
A microscopia eletrônica de varredura (MEV) vem sendo utilizada para localização de microrganismos no sistema de canais radiculares, no interior dos túbulos dentinários, na superfície externa do ápice radicular e região periapical por diversos autores50,79,124,125,159. Por
meio do MEV é possível obter informações da morfologia de superfície do biofilme, morfologia celular e a presença de matriz extracelular polissacarídea.
O Microscópio Confocal, CLSM (Confocal Laser Scanning Microscope) tornou-se uma das ferramentas com mais recursos nas pesquisas que envolvem o biofilme. O Microscópio Confocal emite feixes de luz que se difundem através do biofilme, detectando sua estrutura e formando uma imagem 2D. Toda imagem 2D pode ser sobreposta, e fotos em 3D são produzidas. Marcadores fluorescentes podem ser adicionados para detectarem e identificarem microrganismos, assim como podem ser usados para determinar aspectos bioquímicos, fisiológicos, físico- químicos do meio ao seu redor e diferenciar microrganismos Gram- positivos dos Gram-negativos169. A microscopia Confocal tem sido utilizada em estudos recentes para avaliação do biofilme33,42,43,66,68,118,120,170. Uma das grandes vantagens do Microscópio
Confocal é que ele permite a análise de múltiplas secções do biofilme, em diferentes planos, com facilidade de observação e de preparo das amostras. O padrão de colonização do biofilme, a distribuição em múltiplas camadas, o uso de corantes para diferenciação de alguns morfotipos bacterianos e também das células com e sem viabilidade são bons exemplos da aplicação desta tecnologia.
No entanto, o Microscópio Eletrônico de Varredura e o Miscroscópio Eletrônico de Transmissão (MET) permitem a observação das imagens com resolução muito superior. A observação de detalhes da superfície celular é possível por meio do MEV, e por meio do MET, podemos observar inclusive material intracelular, e diferenciar bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
A não ser que corantes fluorescentes específicos sejam utilizados para componentes da matriz, a presença de material extracelular não pode ser observada no Microscópio Confocal, somente por meio do MET ou MEV33. Por esta razão, utilizamos o MEV para que fosse possível a análise da estrutura do biofilme que estava sendo produzido para este estudo. De acordo com Surman et al.149 (2006) nenhum método de microscopia apresenta aplicação universal, mas usados em conjunto, eles podem complementar uns aos outros, aumentando nosso entendimento da estrutura do biofilme.
A metodologia empregada para o crescimento do biofilme foi adaptada de Walker, Sedlacek165 (2007), e eleita por apresentar os
melhores resultados em testes piloto, onde realizamos o crescimento de biofilmes também em superfície dentinária, membranas de celulose além dos discos de hidroxiapatita. Adicionalmente, foram utilizadas condições de aerobiose e de anaerobiose, e diferentes meios de cultura, até que se chegasse ao presente método, considerado o mais adequado. Os biofilmes apresentaram morfologia regular em todas as amostras e
relativa aderência ao disco de hidroxiapatita, não se desprendendo durante os procedimentos de teste e de preparo para a microscopia. O biofilme criado sobre discos de membrana de celulose não apresentou esta propriedade, e se deslocava facilmente durante o preparo das amostras para a microscopia. O biofilme criado sobre os discos de hidroxiapatita cobriu a maior parte da sua superfície, apresentava espessura de 10 a 20 µm e nele era possível observar também a presença de matriz extracelular. Quando utilizamos a dentina como substrato para o crescimento do biofilme, este tecido, por apresentar configuração anatômica mais complexa, permitiu o crescimento de um biofilme de forma irregular, onde em certas áreas apresentava-se muito espesso, e em outras podíamos observara apenas células bacterianas isoladas. Apesar da dentina como substrato para o biofilme talvez reproduzir mais fielmente as condições in vivo de crescimento bacteriano, julgamos que um biofilme com distribuição e espessura regulares seja mais adequado à avaliação de agentes antibacterianos in vitro.
Empregando o mesmo método utilizado neste estudo, Walker, Sedlacek165(2007) obtiveram 1012a 1014UFC viáveis por amostra
de biofilme. Estes mesmos autores verificaram a formação de agregados de células bacterianas que não se romperam mesmo após a suspensão bacteriana criada a partir do biofilme ser agitada em agitador do tipo Vortex.
Obtivemos por meio desta metodologia, biofilmes de múltiplas espécies, incubados em anaerobiose, o que se assimila com as condições de infecção encontradas no sistema de canais radiculares. Na composição do biofime observamos uma microbiota mista, com presença de agregados de cocos, bacilos e filamentos envoltos em matriz extracelular. Kolenbrander69, Kolenbrander et al70 relataram que o
desenvolvimento do biofime ocorre como uma série de eventos, onde se tem os colonizadores primários, os intermediários e os secundários.
Durante o crescimento do biofilme, podemos observar por meio do MEV que os cocos parecem proliferar mais rapidamente, e que se organizam preferencialmente ao redor dos bacilos e filamentos, formando agregados bacterianos mistos. A partir de sete dias de incubação, já foi possível observar biofilmes bem organizados, na maioria das amostras. No entanto, com 14 dias de incubação, os biofilmes eram mais espessos e com maior quantidade de agregados bacterianos que em períodos menores de crescimento.
O método de avaliação da proporção de células viáveis e não-viáveis em biofilmes desenvolvidos in vitro é relativamente novo. Alguns estudos já utilizaram o Live/Dead® BacLight Bacterial Viability Kit120,161 e o método de avaliação das imagens geradas no Microscópio Confocal pelo software Imaris 5.0, utilizado em nosso estudo foi empregado também por Vishnyakova et al.164em 2006.
O Live/Dead BacLight tem se mostrado um corante efetivo para populações mistas de microrganismos, que permite a diferenciação de células vivas e mortas de acordo com a permeabilidade da membrana citoplasmática62,120,167. Este corante pigmenta as bactérias viáveis de verde, e aquelas com membranas danificadas de vermelho.