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No teste antibacteriano realizado pelo método de exposição direta, todas as soluções avaliadas foram capazes de eliminar o E. faecalis (VP3-181). Após 30 segundos de contato das soluções com a suspensão bacteriana, já foi possível observar uma redução de mais de 70% das células de E. faecalis, independente da solução irrigadora utilizada.

Entretanto, as soluções irrigadoras avaliadas eliminaram completamente o Enterococcus faecalis em tempos bastante distintos. O Tetraclean® e o MTAC (CTR 0,1%) em sua composição resultaram em culturas negativas após o contato com a suspensão bacteriana, já no primeiro tempo experimental, de 30 segundos. O MTAD®, e o MTAD® acrescido de CTR a 0,01% só determinaram a morte da totalidade das células bacterianas após 10 minutos de contato com as mesmas. Com efeito antibacteriano intermediário às outras soluções avaliadas, o MTAC (CTR 0,01%) determinou a morte de todas as células de E. faecalis após 1 minuto, e para o MTAD + CTR 0,01% foram necessários 3 minutos para a total eliminação da cepa bacteriana avaliada.

Giardino et al.46 (2006) também relataram a ação antibacteriana superior do Tetraclean®_{com relação ao MTAD}®_{, quando o}

método de concentração inibitória mínima foi utilizado. Nossos resultados estão de acordo ainda, com aqueles descritos por Johal et al.60 _(2007),

Clegg et al.21_{(2006), Dunavant et al.}35_{(2006), Kho, Baumgartner}67_(2006),

Krause et al.71 _{(2007) e Ruff et al.}122 _{(2006), onde o MTAD}® _não

apresentou atividade antimicrobiana tão satisfatória quanto outros agentes, em testes antibacterianos in vitro.

Ao contrário dos estudos que mostram deficiente ação antibacteriana do MTAD®_{, Torabinejad et al.}156 _{(2003) demonstraram que}

o MTAD® foi tão efetivo quanto o NaOCl a 5,25% e mais efetivo que o EDTA a 17% em um estudo que utilizou a mensuração dos halos de inibição em ágar. Os mesmos autores relataram ainda, que o MTAD® apresentou atividade antimicrobiana superior ao NaOCl a 5,25% pelo teste da mínima concentração inibitória.

Também Shabahang, Torabinejad127 _{(2003) relataram a}

superior capacidade do MTAD® em relação ao NaOCl na desinfecção de tecido dentinário infectado. A desinfecção foi determinada pela presença ou ausência de turbidez no meio de cultura após 96 horas. No entanto os autores não realizaram nenhuma análise quantitativa, apenas qualitativa, da ausência ou presença de crescimento bacteriano. Vale lembrar que com esta metodologia, tanto uma redução de 1% quanto uma redução tão alta como 99% das células viáveis apresenta-se nos resultados como crescimento bacteriano positivo, o que não torna este método com acurácia suficiente para comparação de agentes antibacterianos.

A inconsistência de resultados entre os diferentes estudos pode ser causada por diferenças na metodologia e variações nas espécies microbianas utilizadas. A maioria dos estudos que apontam o bom desempenho do MTAD® _{como agente}

antibacteriano111,121,128,127,156,163_{, não fizeram uso de uma solução}

neutralizante, e por isso o efeito antibacteriano provavelmente decorra do carry over da doxicicilna. Em estudo recente, Krause et al.71 ₍₂₀₀₇₎

também expôs seu julgamento, de que a superioridade do efeito antibacteriano do MTAD®_{em comparação a outros agentes, demonstrado}

por alguns estudos, podem ser aumentado pelo efeito carry over da doxiciclina, uma vez que grande parte dos estudos não inclui o uso de soluções neutralizantes para o MTAD®_{. É importante salientar, que a}

adsorção da doxiciclina à dentina necessita de no mínimo 160 minutos de eluição em água, para que o efeito na doxiciclina seja interrompido20, o

que reforça a necessidade do uso de um neutralizante durante para o MTAD®_{durante testes da ação antibacteriana do mesmo.}

No presente estudo, observamos a maior ação antibacteriana do MTAC, e do Tetraclean® em relação ao MTAD®. Sabemos que a concentração da doxiciclina no Tetraclean®_{é de 1%, e no}

MTAD® _{é de 3%, e portanto, pudemos concluir que a maior atividade}

antibacteriana não deve ser atribuída à doxiciclina. Ao contrário, a cetramida parece ter um papel fundamental na efetividade do Tetraclean®

e no MTAC.

A cetramida, um composto amônio-quartenário, por ser um surfactante, permite que o irrigante se difunda melhor pelo sistema de canais radiculares e pelos túbulos dentinários. Adicionalmente, a ação antibacteriana da cetramida já foi relatada por El-Nima39 (1984) que em seu estudo demonstrou que a cetramida em concentrações entre 0,01% e 0,04% é capaz de aumentar o efeito antibacteriano de alguns antibióticos, o que corrobora com os resultados dos estudos de Botelho12,13 (2003, 2005) e Portenier et al.111_(2006).

De acordo com nossos resultados, a cetramida a 0,01% adicionada ao MTAD® _{não permitiu um aumento significante da atividade}

antibacteriana do mesmo, enquanto na concentração 0,1% a cetramida adicionada ao MTAD® _{permitiu que o E. faecalis fosse eliminado após 3}

minutos de contato com a solução.

Todavia, neste estudo, maior atividade antibacteriana sobre o E. faecalis foi percebida quando ao invés do acréscimo de cetramida foi realizada a remoção do Tween 80 da formulação do MTAD® _{e adição da}

cetramida. Neste caso, a adição da cetramida a 0,01% fez com que o teste resultasse em culturas negativas após um minuto de contato com a suspensão bacteriana, e em uma concentração maior, de 0,1%, a

substituição por cetramida permitiu que o E. faecalis fosse eliminado já em 30 segundos.

A diferença dos resultados antibacterianos do MTAC e do MTAD + CTR podem ser atribuídas à ação neutralizante do Tween 80 sobre a cetramida. O Tween 80 apresenta em diferentes concentrações, capacidade de neutralizar diversas substâncias, o que foi descrito pela primeira vez em 1963, por Smith et al.141(1963). Estes autores verificaram que o Tween 80 a 0,5%, puro ou associado à a-lecitina a 0,1%, apresenta efeito neutralizante da ação de alguns esteróides. Também Engley, Dey40

(1970) apud: Sheikh et al.141, 1981) recomendaram o uso de um neutralizante universal para diversos medicamentos, onde na composição era utilizado o Tween 80 a 0,5% e a a-lecitina a 0,7%.

Zamany, Spangberg171 (2002), afirmaram que a combinação de Tween 80 a 3% e a-lecitina a 0,3% é o melhor agente neutralizante para a clorexidina, permitindo a total recuperação dos microrganismos avaliados, além de não apresentarem nenhum efeito antibacteriano. No presente estudo, realizamos testes adicionais que verificaram a eficácia do Tween 80 a 3% + a-lecitina a 0,3% também como neutralizante do Tetraclean®_{, MTAD}®_{e MTAC. Apesar da neutralização da cetramida já ter}

sido relatada por Heard, Ashworth57 _{(1968), verificamos também uma}

provável inibição do efeito bacteriostático da doxiciclina.

Segundo Heard, Ashworth57(1968), a ação de inativação da clorexidina e da cetramida, um composto amônio-quartenário é provavelmente decorrente da união dos hidrogênios com a cadeia de polioxietileno do Tween 80. Uma vez que tanto a clorexidina e a cetramida apresentam características formadoras de micelas, o Tween 80 também parece agir pela adsorção à superfície destas micelas. O provável efeito inibitório sobre a doxiciclina no entanto, não está esclarecido.

Shabahang et al.128 (2008) substituíram a doxiciclina da formulação do MTAD®_{por clorexidina, e verificaram que esta substituição}

diminuiu a eficácia do MTAD® como agente antibacteriano. Todavia, os autores não atentaram para o fato da presença de Tween 80 a 0,5% na fórmula do MTAD®_{, que inibiria a ação da clorexidina nos casos onde esta}

foi adicionada na fórmula. Em decorrência disso, os resultados com a adição da clorexidina ou a substituição da doxiciclina por clorexidina não foram satisfatórios.

Com relação aos resultados que obtivemos por meio dos testes antibacterianos utilizando o biofilme como modelo experimental, estes corroboram com os achados pelo método de contato direto. Frente ao biofilme, as soluções contendo cetramida em sua composição, e principalmente sem a presença de Tween 80 apresentaram melhor desempenho. Estes resultados estão de acordo com os relatados por Clegg et al.21 _{(2006), onde a aplicação de MTAD}® _{por 5 minutos não foi}

capaz de erradicar as células bacterianas presentes no biofilme.

Em nosso estudo, o MTAD® _{conseguiu eliminar menos de}

50% das células bacterianas presentes no biofilme após um período de 3 minutos. Dunavant et al.35 _{(2006) encontraram resultados ainda menos}

favoráveis ao MTAD®_{. Os autores relataram que ao utilizarem esta}

solução por 5 minutos sobre o E. faecalis organizado em biofilme, apenas 16% das células bacterianas foram eliminadas.

Giardino et al.47 _{(2007) avaliaram o Tetraclean}® _{e o MTAD}®

frente ao biofilme, em períodos experimentais de 5, 30 e 60 min e seus resultados são comparáveis aos do presente estudo. Os autores relataram que o NaOCl a 5,25% foi capaz de romper e remover o biofilme já em 5 minutos, e que o uso do Tetraclean®também ocasionou um maior grau de erradicação do biofilme quando comparado com o MTAD®_.

Conforme relatado na literatura, para eliminar totalmente as bactérias organizadas em biofilmes, são necessárias concentrações de 250 a 1000 vezes maior de antibióticos do que o necessário para eliminar bactérias planctônicas123_{. Nossos resultados vão ao encontro destas}

informações, onde as células bacterianas organizadas em biofilme apresentaram-se mais resistentes à ação antimicrobiana das soluções que quando na forma planctônica. Vale lembrar que não só a organização dos microrganismos diferencia as duas metodologias, mas também o fato de no teste de contato direto termos utilizado apenas uma cepa de E. faecalis, e os biofilmes serem constituídos por múltiplas espécies incubadas em anaerobiose. Semelhante aos nossos achados, no estudo de Sedlacek, Walker123 _{(2007), os antibióticos avaliados, entre eles a}

doxiciclina, deixaram viáveis 50 a 60% das células bacterianas presentes no biofilme em crescimento por 10 dias, comprovando a maior resistência do biofilme em relação às células bacterianas na forma planctônica.

Um dos principais mecanismos de resistência do biofilme está diretamente relacionado à falha na difusão dos agentes por toda extensão do biofilme. Substâncias poliméricas, como as presentes na composição da matriz extracelular, retardam a difusão das agentes químicos e dos antibióticos. A velocidade de penetração parece variar de acordo com os microrganismos e composição da matriz de exopolissacarídeo do biofilme22,23,.

Sabe-se que microrganismos com baixo metabolismo são menos suscetíveis aos agentes antimicrobianos22,23,169_{. Sendo assim,}

outro mecanismo de resistência do biofilme está relacionado com a capacidade dos microrganismos organizados em comunidades, permanecerem por longos períodos com escassez de nutrientes, e de oxigênio, o que conseqüentemente diminui sua taxa metabólica2,11_.

Um terceiro mecanismo de resistência do biofilme está relacionado com a expressão de genes resultantes de sinais químicos enviados por outras células bacterianas presentes no mesmo ambiente, mecanismo esse denominado quorum sensing. Assim, algumas células podem se tornar diretamente mais resistentes por meio da modificação em seu fenótipo, ou ainda podem passar a secretar maior quantidade de matriz extracelular, para a maturação do biofilme22_.

Nos espécimes de biofilme avaliados na Microscopia Confocal, não foi observamos a ruptura do biofilme por nenhuma das soluções irrigadoras avaliadas, à semelhança de Clegg et al.21(2006) que também relatou, por meio da microscopia eletrônica de varredura, que o MTAD® não apresentava a propriedade de romper o biofilme. Todavia, uma solução irrigadora para ser considerada ideal deve apresentar propriedades não só de tornar as células do biofilme não viáveis, mas também de desfazer a estrutura do biofilme. A presença de um biofilme intacto, mesmo com células mortas pode, por exemplo, prevenir uma obturação adequada dos canais radiculares, evitando a adesão e adaptação do cimento obturador nas paredes dentinárias. Adicionalmente, se após a obturação ocorrer a degradação das células bacterianas remanescentes do biofilme, restarão espaços na obturação, que poderão resultar em uma falha do tratamento endodôntico. No entanto, o fato do MTAD® e do Tetraclean® clinicamente terem seu uso associado ao NaOCl, pode tornar esta inabilidade de rompimento do biofilme secundária do ponto de vista clínico, uma vez que o NaOCl, principalmente em soluções concentradas (3% - 6%), apresenta capacidade de rompimento da estrutura do biofilme21_.

Nas secções do biofilme observadas pela Microscopia Confocal, muitas vezes foi difícil a delimitação das áreas de células viáveis e de células não viáveis. Ao se sobreporem, na maioria das

amostras observamos tonalidades intermediárias ao verde e ao vermelho, como o cor de laranja e o amarelo por exemplo.

Em alguns casos, entretanto, foi possível observar agregados de çélulas não viáveis, circundadas por células viáveis, formando verdadeiras “ilhas” de células mortas. Este aspecto do biofilme já foi previamente descrito em estudos in vivo4_{e in vitro}120_.

Sabe-se que as bactérias podem se tornar resistentes quando em contato com antibióticos. Os enterococos por exemplo, têm adquirido determinantes genéticos que conferem resistência a várias classes de antibióticos, incluindo eritromicina, tetraciclina, cloranfenicol, e vancomicina88,90,91,132. A alta resistência dos E. faecalis às tetraciclinas já foi relatada em alguns estudos: 58% por Rams et al.116_{(1992), 65.1% por}

Udo et al.160 (2002) e 68.5% por Cotter, Adley25 (2001), e é mediada por vários genes que levam à eliminação ativa da tetraciclina da célula bacteriana, ou à diminuição da afinidade dos ribossomos bacterianos pela tetraciclina87,91.