Countercyclical Buffer

Um grande número de hipóteses para explicar como o prejuízo do fluxo biliar leva à lesão hepática têm sido propostas, mas a maioria dos pesquisadores acredita que o acúmulo dos ácidos biliares hidrofóbicos no hepatócito seja o fator chave envolvido (GREIN et al., 1972; BALISTRELI et al., 1996). Sua citotoxidade está relacionada às propriedades detergentes e à hidrofobicidade de cada um deles. O potencial hepatotóxico dos ácidos biliares em ordem decrescente é: ácido litocólico > deoxicólico > quenodoxicólico > cólico> ursodeóxicólico. A sulfatação e conjugação de ácidos biliares reduz sua hepatotoxidade, pois aumenta a afinidade pela água, facilitando a eliminação pela urina e pelas fezes.

Nos últimos vinte anos o estudo da morte celular causada pela retenção de ácidos biliares na colestase centrou-se, inicialmente, na sua relação com a necrose e, mais recentemente com a apoptose.

1.6.2.1 ÁCIDOS BILIARES E NECROSE

A necrose causada por ácidos biliares foi atribuída, principalmente à sua ação detergente, além de outros mecanismos:

1) Propriedades detergentes (GREIN et al., 1972; COMBETTES et al., 1988). Embora os ácidos biliares se acumulem no fígado durante a colestase é improvável que os níveis observados nesses casos, sejam suficientes para que sua

atividade detergente lese as membranas celulares. Além disso sua toxicidade pode ser observada mesmo abaixo da concentração micelar crítica (REICHEM, 1994).

2) Mudanças na homeostase do cálcio intracelular (SPIVEY et al.; 1993) - Provavelmente por sua ação detergente, os ácidos biliares aumentam a permeabilidade das membranas das organelas, especialmente do retículo endoplásmico, liberando íons cálcio para o citosol. Nesse compartimento ativam proteases dependentes do cálcio e a quinase da proteína c que atuam como mensageiros secundários para a morte celular (SCHOLMERICH et al., 1996; PATEL et al., 1998).

3) Aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) - Este aumento e o conseqüente estresse oxidante na colestase é um dos fatores que pode levar a lesão celular (KRÄHENBÜHL et al., 1995a; SINGH et al., 1992; SOKOL et al., 1993). A hipótese oxidativa para explicar parte da lesão colestática, ganhou sustentação por um série de observações pertinentes ao aumento da peroxidação lipídica encontrado no sangue de crianças com colestase crônica (LUBRANO, 1989). Uma peroxidação significativa dos lipídios da membrana foi demonstrada em hepatócitos isolados e mitocondrios hepáticos seguida à exposição a ácidos biliares hidrofóbicos (SPIVEY et al., 1993). De LANGE & GLAZER, 1990 utilizando uma concentração milimolar de ácidos biliares demonstraram, num sistema in vitro, que estes podem inibir a peroxidação (ação antioxidante) em baixas concentrações de lipídios insaturados enquanto que, em concentrações aumentadas, os ácidos biliares podem promover a peroxidação lipídica. DAHM (1988) demonstrou que o ácido litocólico, que é monohidroxilado e, portanto, altamente hidrofóbico aumentou oito vezes (32-100µmol/L) a liberação de superóxido a partir de leucócitos polimorfonucleares após preparação com um éster de forbol. Concentrações similares de ácidos dihidroxilados, embora em concentrações maiores, causaram um aumento bem menor de superóxido; o ácido cólico produziu um aumento mínimo na geração de superóxido. Diferentes observações experimentais corroboram a idéia de que a peroxidação lipídica contribui para a lesão na colestase: 1) a detecção de peroxidação lipídica em mitocrondios isolados de ratos

com ligadura de colédoco (SOKOL et al., 1991b); 2) há diminuição das defesas antioxidantes no fígado de ratos com ligadura de colédoco (SINGH et al., 1992) e 3) o possível efeito pró-oxidante de ácidos biliares em hepatócitos isolados (SOKOL et al., 1993). Evidências clínicas da geração de radicais livres durante a colestase incluem: 1) aumento dos níveis plasmáticos de eritrócitos e peróxidos lipídicos no plasma de crianças com colestase crônica (LEMMONNIER et al., 1987; LUBRANO et al., 1989), 2) o efeito nocivo da dieta com alto teor de gordura e dos produtos finais da peroxidação lipídica em crianças com colestase crônica. O conteúdo de gordura da dieta, parece influenciar a composição lipídica das frações subcelulares da membrana do hepatócito (KOOLS et al., 1989). Havendo aumento dos ácidos graxos polinsaturados, os substratos para a peroxidação lipídica estarão aumentados, consequentemente, existirá uma propensão aumentada para a peroxidação lipídica, elevação da fosfatase alcalina sérica e aumento da concentração de bilirrubina (DEEMS et al., 1989). A manipulação de substâncias antioxidantes e pró-oxidantes da dieta pode modular o grau da lesão hepática por radicais livres durante a colestase (SOKOL, 1992); a suplementação com vitamina E de crianças com colestase e deficiência dessa vitamina foi associada a diminuição da concentração dos níveis séricos de ácidos biliares, sugerindo uma redução da lesão hepática com reversão da deficiência antioxidante (SOKOL, 1986).

4) Prejuízo na cadeia de transporte mitocondrial - Observou-se que os ácidos biliares interferem no transporte de elétrons e na fosforilação oxidativa dos mitocôndrios (LEE & WHITEHOUSE, 1965); há produção aumentada de ROS o que pode agravar a lesão mitocondrial pois lesam proteínas e membranas lipídicas dessas organelas, perturbam sua função e, em especial, interferem com a cadeia de transporte de elétrons, enzimas da matriz mitocondrial e β oxidação (KRÄHENBUHL et al., 1994b; SOKOL, 1995).

Outra forma de liberação de ROS pelos ácidos biliares é por sua ação sobre os neutrófilos e os macrófagos, que são frequentemente encontrados no infiltrado inflamatório do trato portal em fígados colestáticos de humanos e de ratos com ligadura do colédoco, (KONTOURAS et al., 1984; SCHEUER, 1980). A

produção de radicais livres por macrófagos isolados de fígado de ratos com colestase acompanha o aumento da produção de prostaglandinas E2, caracterizando uma

resposta inflamatória (ADACHI et al., 1992). Em ratos com colestase obstrutiva, as defesas antioxidantes estão prejudicadas pela redução: a) da concentração de vitamina E no plasma por má absorção decorrente da falta de ácidos biliares no intestino delgado; b) das atividades das enzimas peroxidase e transferase da glutationa no fígado; c) da catalase; d) do selênio no sangue; e) da glutationa total hepática; f) da dismutase do superóxido e ubiquinona 9 e ubiquinona 10 (SING et al., 1992; BEYER, 1990; HALLIWELL, 1991). As enzimas antioxidantes contrabalançam a geração de radicais livres. TOGASHI et. al. (1990) demonstraram que a atividade destas enzimas estão diminuídas nas doenças hepáticas, possivelmente aumentando a suscetibilidade do fígado à lesão por radicais livres de oxigênio. A combinação de ácidos biliares, acúmulo de cobre e a depleção das enzimas antioxidantes leva à lesão do fígado por radicais livres durante a colestase.

1.6.2.2 ÁCIDOS BILIARES E APOPTOSE

O estresse oxidante tem um papel chave na apoptose induzida por sais biliares (YERUSHALMY et al.,2001). PATEL e colaboradores (1994) usando cultura de hepatócitos de ratos tratados com ácidos biliares hidrofóbicos (glicoquenodeoxicólico e glicodeoxicólico) demonstraram mudanças morfológicas clássicas de apoptose.

A apoptose é um processo fisiológico que contribui para a renovação celular. Desta forma uma certa proporção de células no fígado estão constantemente sofrendo apoptose (BURSCH et al., 1990). A apoptose é raramente reconhecida em secções histológicas em razão da rapidez com que as células apoptóticas são removidas ou eliminadas (BHATHAL et al., 1985). As células epiteliais biliares apoptóticas são raramente observadas em razão do seu tamanho pequeno e a rapidez que são secretadas na bile. Na apoptose das células estreladas hepáticas (FRIEDMAN, 1999) ocorre uma perda seletiva das células com alta

expressão dos inibidores tissulares das metaloproteinases (TIMP). A perda seletiva desta população reduz a inibição das colagenases intersticiais, aumentando a degradação da cicatriz e apressando a volta a histologia normal.

Há evidências de que o estresse oxidativo contribua para a apoptose induzida por sais biliares (PATEL & GORES, 1997) - durante a colestase ácidos biliares em concentrações acima das fisiológicas se acumulam dentro do hepatócito, distribuem-se nas membranas celulares, incluindo a membrana interna dos mitocondrios onde promovem a geração de radical oxigênio e a conseqüente peroxidação lipídica.

A peroxidação lipídica por estresse oxidativo é amplamente reconhecida como um mecanismo indutor da apoptose. Atualmente sabe-se que baixos níveis de estresse oxidativo com peroxidação lipídica podem resultar em apoptose. A via bioquímica mais precisa na qual a peroxidação lipídica por produtos desse estresse resulte em apoptose ou quando o estresse oxidativo é um mecanismo sinalizador da fase de ocorrência da apoptose permanece obscura (JACOBSON, 1996).

Os ácidos biliares hidrofóbicos estimulam a geração de espécies reativas de oxigênio em hepatócito isolados, cultura de hepatócitos primários e mitocondrios purificados de ratos.

O aumento da MPT (transição da permeabilidade da mitocondria) está associado ao aumento dos mitocondrios, ao colapso do potencial de membrana, a redução da fosforilação oxidativa, a ruptura da membrana externa dos mitocondrios, a liberação do citocromo C e a geração de espécies reativas de oxigênio (LEMASTERS et al., 1998). Ácidos biliares hidrofóbicos induzem a MPT em mitocôndrias hepáticas e em cultura de hepatócitos primários (BOTLA et al., 1995; SOKOL, 1999).

Outros estudos revelam o papel para a ativação e translocação da quinase da proteína c, cuja associação com o aumento do magnésio e ativação de proteínas endonucleases causam cisão do DNA nuclear (KUROSAWA et al., 1999).

Alternativamente, tem sido proposto que a indução das MPT por si só podem aumentar a produção de ROS a partir da cadeia respiratória através da liberação do citocromo c mitocondrial (LIU et al., 1996) o que então, prejudica a transferência de elétrons do complexo III e IV da cadeia respiratória. Tem sido proposto que a cisão do Bid (promotor da apoptose) pela caspase 8 ativada, pode translocar para a mitocôndria e estimular a liberação do citocromo c (pela indução da MPT ou por outro mecanismo). É possível que este sinal intracelular estimulado pela ativação do receptor de morte celular - Fas esteja também envolvido na liberação do citocromo c. A perturbação resultante da transferência de elétrons pode ter o mesmo efeito como a inibição direta da atividade do complexo III pelos ácidos biliares, promovendo um escape de elétrons no complexo III ubiquinona e geração de superóxido. O aumento de ROS pode sucessivamente causar oxidação crítica dos tióis localizados nos poros de transição de permeabilidade, causando posteriormente a MPT com subseqüente liberação do citocromo c dos mitocrondios.

O estresse oxidante desempenha um papel crítico na apoptose induzida pelos ácidos biliares. Três vias nas quais os ácidos biliares podem iniciar a apoptose hepatocelular tem sido identificadas:

1) Ativação da apoptose - Recentemente, várias mecanismos de ação celular tem sido propostos para explicar o envolvimento dos ácidos biliares na apoptose incluindo o receptor de morte celular (Fas). A apoptose hepatocítica parece ser iniciada pela ativação do Fas (FAUBION et al., 1999). A oligomerização do Fas que é um receptor de superfície da transmembrana celular que pode mediar a apoptose e pertence aos receptores da família do TNF (fator de necrose tumoral) com subseqüente recrutamento do FADD (Fas associated death domain)-região letal ativada pelo Fas - pela ação dos sais biliares, resulta na ativação de proteases da cisteína, referida como caspases, especialmente caspase 8. A caspase 8 atua no núcleo e ativa a apoptose pela cisão da caspase 3 e a ativação da catepsina B (SALVESEN & DIXIT, 1997). A ativação do ligando do receptor de morte Fas, tem sido mostrado em cultura de hepatócitos expostos a concentrações de glicoquenodeoxicólico que causa apoptose. A ativação deste receptor de morte,

presumivelmente leva a subseqüente ativação das caspase-8, catepsina B, e atraem caspases efetoras (3 e 9) que participam da característica fragmentação celular da apoptose. Os sais biliares tóxicos (glicoquenodeoxicolato e glicodeoxicolato) induzem apoptose diretamente nos hepatócitos (PATEL et al., 1994) ativando o Fas. Este estimula o FAAD, que ativa a caspase 8 e apoptose subsequente através da cisão do Bid e por translocação para dentro da mitocôndria ou por ativação direta das caspases efetoras distais;

2) Alterações mitocondriais - Perturbações da membrana mitocondrial são importantes características da apoptose induzida por ácidos biliares. Considera-se que o mitocôndrio desempenha um papel crítico na indução da apoptose celular, funcionando como executora central. As evidências para tal ação são demonstradas pelas seguintes observações: 1) a perda do potencial da membrana antecede outras características de apoptose em várias células; 2) as proteínas citoplasmáticas da família das Bcl-2 que regulam as funções de apoptose, pelo menos em parte, através da ligação e interação com as membranas mitocondriais: 3) a liberação do citocromo c, que é um fator indutor de apoptose, para dentro do citosol, onde ativa as caspases efetoras distais. A importância de alterações na permeabilidade transitória da mitocondria (MPT) tem sido destacada ultimamente (YERUSHALMY et al., 2001). A MPT se caracteriza por um aumento rápido da permeabilidade da membrana mitocondrial a solutos de baixo peso molecular, causado pela abertura de um canal composto de: 1) um translocador de adenina nucleotídio na membrana interna; 2) um canal de ânions dependente de voltagem, na membrana externa e 3) a ciclofilina D mitocondrial (LEMASTERS et al., 1998). Os ácidos biliares induzem o MPT através da produção de ROS - os ácidos biliares estimulam diretamente a geração pela cadeia respiratória mitocondrial de ROS, por prejudicarem o transporte de elétrons na cadeia respiratória (promovem o escape de elétrons no sítio de interação do complexo III ubiquinona aumentando a formação de superóxido e espécies reativas de oxigênio mais tóxicos). liberação para o citosol do citocromo c. Rodrigues et al (1998) observaram o efeito citoprotetor do ácido ursodeoxiclólico, um ácido biliar hidrofílico, que na colestase pode estar relacionada com sua capacidade de inibir a MPT.

3) Translocação de Bax - Os ácidos biliares podem ativar a tranlocação de Bax - uma proteína pró apoptótica - para os mitocondrios, onde funcionam como um canal para também liberar citocromo c para o citosol onde ativa as caspases efetoras distais, 3 e 9 (YERUSHALMI et al., 2001). Esta via intracelular atribuída à ação dos ácidos biliares é semelhante àquela observada em outros modelos de apoptose, nos quais o Bax estimula a liberação do citocromo c da mitocôndria o qual se liga ao Apaf-1 (fator ativador de proteases efetoras da apoptose), que ativa em seguida a caspase-9, resultando na subseqüente ativação de caspases distais (NARITA et al., 1989; GREEN & KROEMER, 1998).

Em hepatócitos humanos, a apoptose induzida por sais biliares pode ser evitada pelo ácido biliar hidrofílico tauroursodeóxicolato e também por um composto antioxidante hepatoprotetor – S-adenosylmethionina (SAME).

A inibição da MPT com bloqueadores específicos tais como a ciclosporina A melhora a ativação das caspases e apoptose em vários sistemas celulares (KROEMER & REED, 2000).

Em resumo, a retenção dos ácidos biliares é o principal fator da lesão hepatocítica na colestase que atua principalmente pela liberação de espécies reativas de oxigênio e pelo estimulo direto à apoptose.

1.6.2.3 MECANISMOS DA FIBROSE HEPÁTICA NA COLESTASE

A fibrose hepática pode resultar de diversas formas de lesão aguda ou inflamação. Estudos da morfologia da lesão fibrótica hepática enfatizam o acúmulo da matriz extra-celular, a transformação de células estreladas para miofibroblastos ativos, a redução dos lipídios da células estreladas e do retinol total hepático (BLOMHOFF et al., 1991). O processo que leva à fibrose é semelhante ao processo de cicatrização, incluindo as fases subsequentes à lesão celular (reparação celular): inflamação aguda, síntese dos componentes da matriz extra-celular colágena e não colágena. Se uma agressão inicial persiste, os mecanismos de reparação tissular

tenderão a se prolongar, aumentando a fibrose tissular que se torna predominante sobre a regeneração hepatocelular. A substituição da matriz subendotelial normal por um tecido cicatricial é acelerada pelas células estreladas hepáticas através da secreção da colagenase tipo IV também chamada de gelatinase A (FRIEDMAN, 1999). Os componentes da matriz extra-celular na fibrose são os mesmos das condições normais, porém em quantidades muito aumentadas e com distribuição anatômica diferente e, talvez, em proporções diferentes (SCHUPPAN, 1993).

Diferentes tipos de células hepáticas têm a capacidade de sintetizar os componentes da matriz extra-celular (FRIEDMAN, 1999), modular o crescimento celular, a migração de células móveis, a expressão de genes e outras funções celulares importantes, interagindo diretamente com moléculas de adesão celular e, indiretamente, pela retenção de biomoléculas mitogênicas nas suas formas ativas e inativas (SCHUPPAN, 1993). O que desencadeia a atividade destas células para a produção de matriz extra-celular ou para a sua degradação, são sinais moleculares representados por diferentes polipeptídeos liberados por vários tipos celulares, principalmente por linfócitos e macrófagos.

As células de Küpffer ativadas liberam espécies reativas de oxigênio, mediadores imunológicos e fatores quimiostáticos que aumentam a resposta inflamatória (SAUER et al., 1995). As células endoteliais também desempenham um papel importante. Na colestase experimental, elas liberam rapidamente um pulso de fibronectina para dentro do espaço de Disse. Uma das isoformas de fibronectina, chamada de fibronectina EIIIA, facilita a ativação de células estreladas. Desta forma, o início da fibrose pode ser atribuído as células endoteliais. Estas células tem uma expressão de colágeno aumentada durante a fase inicial da lesão hepática (MAHER & McGUIRE, 1990), embora sua contribuição seja quantitativamente menor e qualitativamente diferente quando comparada com a das células estreladas.

Uma das características mais importantes da fibrogênese hepática é a ativação de células estreladas hepáticas após uma lesão. Esta ativação parece ser provocada por três estímulos: deposição rápida de fibronectina, liberação de

estímulos solúveis pelas células de Küpffer e liberação de espécies reativas de oxigênio. As células estreladas são consideradas as principais produtoras de matriz extra-celular na fibrose hepática (PINZANI, 1995). Sua população se expande após uma lesão hepática e contribuem para a reparação da lesão, remodelando a matriz extra-celular. Na lesão hepática aguda, ocorre uma expansão na população e aquisição de características dos miofibroblastos semelhantes à musculatura lisa pelas células estreladas (MATHEW et al., 1994).

Na lesão hepática crônica as células se diferenciam em células semelhantes aos miofibroblastos com marcada expressão para α actina de musculatura lisa e ocasionalmente expressão para desmina. A diferenciação é gradual, ocorrendo um estágio intermediário no qual elas são chamadas “células de transição” e é regulada por uma intrincada cadeia de comunicação intercelular entre células estreladas e células de Küpffer ativadas (macrófagos hepáticos), hepatócitos danificados, plaquetas , células inflamatórias e endoteliais, envolvendo citoquinas e mediadores não peptídeos, tais como espécies de oxigênio reativo, eicosanóides e acetaldeído (HAUTEKEETE, 1997; KAWADA, 1997

As células estreladas ativadas produzem uma grande quantidade de colágeno tipo I e tipo III (constituintes da chamada matriz fibrilar), substituindo gradualmente as fibras colágenas normalmente existentes no espaço de Disse (matriz subendotelial normal) e entre as placas celulares de hepatócitos. A produção de colágeno dos tipos I e II parece predominar sobre a síntese do colágeno tipo IV e de outros componentes da matriz extra-celular. Além disso, produzem o fator de

crescimento transformante (TGF-β1) que desencadeia o processo de fibrose hepática.

Na lesão tecidual hepática provocada, como por exemplo, na administração de CCL4 em ratos ou hepatite viral aguda não complicada em

humanos, a ativação de células estreladas bem como de outras células parenquimais implica em uma interação complexa dentre os componentes da matriz extra-celular, citoquinas, fatores de crescimento, polipeptídios e outros mediadores solúveis. Neste contexto, a quiomiotaxia e proliferação das células estreladas e outras células produtoras de matriz extra-celular, representam um evento chave na restauração de

uma rede de matriz extra-celular indispensável para a correta reparação tecidual. Neste estádio “reversível” de ativação, as células estreladas podem também contribuir junto com as células endoteliais sinusoidais para a regeneração hepatocelular pelo suprimento de fatores solúveis como o fator de crescimento

hepatocítico (HGF) (MAHER, 1993).

Estudos realizados nos anos recentes tem enfatizado vários aspectos importantes, relacionados ao início da ativação da células estreladas. O primeiro elemento importante diz respeito à interrupção do padrão normal da matriz extra-celular que se segue a lesão tecidual hepática e inflamação aguda.

A perda da adesão com os vários elementos constituintes da matriz extra celular semelhantes a membrana basal, no espaço de Disse, é provavelmente o que determina um marcado aumento das propriedades de síntese e proliferação das células estreladas hepáticas (PINZANI & MILANI, 1998). Outro importante aspecto relacionado à iniciação da ativação diz respeito à exposição das células estreladas aos mediadores solúveis que podem afetar seu potencial de síntese e/ou proliferação. Estes mediadores, genericamente definidos como mediadores “inflamatórios” podem estar presentes por tempo limitado ou presentes de forma crônica de acordo com a natureza, extensão e repetição da lesão parenquimal. As citoquinas constituem a maior classe de mediadores responsáveis pela “ativação” de células estreladas hepáticas in vitro e in vivo. Elas são divididas em a) citoquinas mitogênicas - fator de

crescimento transformante α (TGF α), fator de crescimento derivado das plaquetas

(PDGF), interleucina 1 (IL1), fator de necrose tumoral α (TNFα), fator de

crescimento semelhante à insulina (IGF) e b) citocinas fibrogênicas (fator de

crescimento transformante β (TGFβ) e interleucina 6 (IL6). Adicionalmente a sua

função mitogênica (estimulação da proliferação celular) e propriedades fibrogênicas (indução da matriz protéica) elas também apresentam uma característica chave da ativação das células estreladas incluindo a perda de vitamina A, estímulo de migração, aumento da contratilidade celular, indução da matriz das metaloproteinases e inibidor tecidual da metaloproteinases (TSUKAMOTO, 1999). Estudos experimentais consolidados indicam que dois fatores de crescimento

polipeptídios, chamados de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e