4. Impact of the New Basel Regulations
4.1 Cost of Funding
VARIÁVEL
CONCLUSÃO
Níveis séricos de vitamina A A administração de vitamina A hidromiscível
durante o experimento elevou significativamente os níveis séricos de vitamina A tanto nos animais controle quanto nos animais com colestase.
A0 (LA0 e SA0) x A50 (LA50 e SA50) s. A0 (LA0 e SA0) x A100 (LA100 e SA100) s. A50 (LA50 e SA50) x A100 (LA100 e SA100) n.s.
Mortalidade espontânea Houve diferença estatísticamente siginificativa entre a proporção de mortalidade dos grupos com ligadura quando comparados com seus controles. Teste exato de Fisher
LA0xLA50 - p≤0,001 s. LA0xLA100 - p≤0,001 s. LA0xSA0 - p≤0,001 s. LA50xLA100 - p=1,000 n.s. LA50xSA50 - p≤0,001 s.. LA100xSA100 - p=1,000 n.s. SA0xSA50 - p=1,000 n.s. SA0xSA100 - p=1,000 n.s. SA50xSA100 - p=1,000 n.s.
Mortalidade após dose de pentobarbital
Houve diferença estatísticamente significativa entre a proporção de mortalidade após a dose de pentobarbital entre os grupos com colestase e os grupos controles. Teste exato de Fisher
LA0xLA50 - p≤0,001 s.. LA0xLA100 - p≤0,001 s.. LA0xSA0 - p≤0,001 s.. LA50xLA100 - p=1,000 n.s. LA50xSA50 - p=1,000 n.s. LA100xSA100 - p=1,000 n.s. SA0xSA50 - p=1,000 n.s. SA0xSA100 - p=1,000 n.s. SA50xSA100 - p=1,000 n.s.
Continuação
Intensidade da Fibrose A presença de colestase relacionou-se com uma
maior íntensidade de fibrose entre o grupo com ligadura quando comparados com os controles.
V.A. dentro dos ligados: SNK A0xA100 s.
A0xA50 n.s. A50xA100 n.s.
V.A. dentro dos simulados A50xA100 n.s.
A500xA0 n.s. A0xA100 n.s.
LxS dentro do nível A0 s. LxS dentro do nível A50 s. LxS dentro do nível A100 s.
Intensidade da
Inflamação A presença de colestase se relacionou com maior intensidade da inflamação entre os grupos com
ligadura quando comparados com os controles, mas não demonstramos interferência da vitamina A. SNK LxS s.
Intensidade da Proliferação
ductal A presença de colestase se relacionou com maior íntensidade de proliferação ductal entre os grupos com ligadura quando comparados com os controles.SNK
LxS s.
Comparações para V.A.: V.A. dentro dos ligados: A0xA100 s.
A0xA50 n.s. A50xA100 s.
V.A. dentro dos simulados A50xA100 n.s.
A50xA0 n.s. A0xA100 n.s.
LxS dentro do nível A0 s. LxS dentro do nível A50 s. LxS dentro do nível A100 s.
6. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
NÍVEIS SÉRICOS DE VITAMINA A
O nível de vitamina A no soro aumentou com a administração de doses de 50 e 100 U.I./g de peso do animal/dia em relação aos que não receberam vitamina. O nível sérico foi menor nos grupos com colestase obstrutiva do que nos controles. Não houve interação entre a dose administrada e o efeito da colestase sobre o nível sérico da vitamina A. Neste caso, o erro β foi de 0,95, o que sugere que outra experiência com um maior número de observações poderia demonstrar essa interação.
A observação de níveis séricos mais baixos de vitamina A no grupo com colestase, sem administração de vitamina A hidromiscível, pode ser explicada pela má absorção de vitamina A da dieta decorrente da ausência de bile no intestino, além da má nutrição protéica, deficiência de zinco e da função de síntese hepática diminuída. Estes dois últimos fatores resultam na diminuição da síntese de RBP e, assim em níveis mais baixos de retinol no sangue.
A observação de que a administração de vitamina A hidromiscível nos ratos com colestase associou-se a níveis séricos mais elevados de vitamina A do que os níveis de ratos com colestase é explicada pela melhor absorção desse preparado. Entretanto os ratos com colestase e administração de vitamina A hidromiscível não chegaram a apresentar níveis séricos de vitamina A semelhantes aos dos controles. Esta observação pode ser devida aos dois fatores mencionados acima (má-absorção, deficiência de zinco e prejuízo na síntese proteica incluindo a de RBP).
A observação de que não houve aumento dos níveis séricos de vitamina A quando se passou da dose de 50 para 100 U.I./g de peso do animal/dia poderia ser explicado pela ativação do catabolismo da vitamina A na presença de concentrações hepáticas elevadas de retinol (LEO, 1989), que seria um mecanismo homeostático visando proteger, em parte, o organismo dos efeitos tóxicos de doses elevadas da vitamina A (GUILAND & LEQUEU, 1995).
MORTALIDADE ESPONTÂNEA
A mortalidade tem sido utilizada como critério de avaliação da lesão hepatocítica em vários modelos experimentais.
Kimmings et al. (1999) utilizou a mortalidade para estudar o aumento da susceptibilidade à endotoxinemia em ratos com ligadura do ducto biliar e observou uma redução na mortalidade de 75 % para 8% tratando estes animais com BPI (bactericidal/permeability-increasing protein - proteína de aumento da permeabilidade bactericida).
Sewnath et al (2000) utilizou a mortalidade para estudar os efeitos da infusão de lipoproteína de alta densidade reconstituída - rHDL (reconstituted
hight-density lipoprotein) no resultado da resposta inflamatória induzida por
lipopolissacárides em ratos com colestase. A infusão de rHDL resultou em aumento da sensibilidade e em mortalidade de 88% no grupo de animais com ligadura do ducto biliar e que recebeu rHDL; 44% no grupo ligado e que recebeu solução salina; 25% no grupo simulado e que recebeu rHDL e 0% no grupo simulado e que não recebeu rHDL.
Harry et al. (1999) utilizou a mortalidade para estudar a sensibilidade de ratos com ligadura do colédoco à administração de lipopolissacárides.
Ito et al (2000) utilizou a mortalidade para estudar o efeito de baixas doses de lipoproteínas em ratos com obstrução do ducto biliar comum.
No nosso experimento a vitamina A hidromiscível protegeu os animais dos efeitos lesivos da colestase - a mortalidade foi maior no grupo com colestase que não recebeu vitamina A (LA0 - 87%) do que nos grupos com colestase e com vitamina A (LA50 - 0%; LA100 - 9,1%). Os animais do experimento provavelmente morreram por encefalopatia hepática já que não foram encontrados nos mesmos sinais de hemorragia ou de infecção.
A encefalopatia hepática pode resultar de disfunção hepática aguda, disfunção hepática crônica ou de shunt porto-sistêmico.
Embora a patogênese da encefalopatia hepática não esteja completamente esclarecida, vários mecanismos têm sido propostos. O consenso geral é de que a encefalopatia hepática reflita anormalidades neurofisiológicas/metabólicas ao invés de uma lesão estrutural do cérebro. A encefalopatia tem sido tradicionalmente considerada secundária ao acúmulo de produtos tóxicos que não são metabolizados pelo fígado. Evidências mais recentes sugerem que a encefalopatia ocorre por:
1) Aumento da osmolaridade no cérebro por hiperamoniemia e aumento na produção de glutamina; o aumento da osmolaridade leva a edema cerebral com aumento da pressão intracraniana e hipoxia cerebral.
Níveis de amônia no sangue arterial estão elevados em 90% dos pacientes com encefalopatia hepática; entretanto, alguns pacientes com encefalopatia grave apresentam níveis normais ou elevação limítrofe dos níveis de amonia arterial (FERENCI,1992; LOCKWOOD,1979). Por outro lado níveis elevados de amoniemia foram detectados em crianças sem sinais clínicos de encefalopatia, quatro ou cinco vezes acima do normal. Entretanto, a maioria dos fatores precipitantes da encefalopatia (hemorragia gastro-intestinal, por ruptura de varizes esofageanas ou de varizes gástricas ou por gastropatia congestiva; septicemia, pelo aumento do catabolismo proteico ou pela hipotensão arterial, hipocaliemia – que aumenta a produção de amônia pelo rim – secundaria ao uso de diuréticos, de laxantes ou a paracentese; desidratação, que diminui a perfusão hepática) resultam ou poderiam resultar em hiperamoniemia. O aumento da amônia no sangue pode ser consequência do prejuízo da transformação hepática de amônia em uréia, de shunts porto- sistêmicos intra e extra-hepáticos e da perda muscular, que frequentemente acompanha a doença hepática crônica, com conseqüente catabolismo proteico (SCHAFER,1990). Outro fator da hiperamoniemia, neste caso, seria a diminuição da captação de amônia pela síntese de glutamina a partir do glutamato pela glutamina
sintetase muscular que é um mecanismo normal para remoção de amônia extrahepática (MARLISS,1971).
O metabolismo da glutamina no cérebro também parece estar relacionada com a patogenia da encefalopatia hepática. Há produção aumentada da glutamina no cérebro a partir da amônia pela enzima glutamina sintetase dos astrócitos (ALBRECHT, 2001). Na insuficiência hepática aguda, a ação osmótica da glutamina acumulada parece ser responsável em grande parte pelo edema cerebral que leva a prejuízo do fluxo sangüíneo, hipóxia e alteração na homeostase iônica. (ALBRECHT, 2001). Na insuficiência hepática crônica, não acompanhada de edema cerebral, o transporte aumentado de glutamina do cérebro para a periferia acelera a passagem pela barreira hemato-encefálica de aminoácidos aromáticos, que são transformados em metabólitos diretamente responsáveis pela encefalopatia hepática (ver abaixo); além disso, a síntese aumentada de glutamina, com diminuição de glutamato, contribui para o prejuízo do metabolismo energético cerebral como explicado a seguir.
2) Comprometimento do metabolismo energético
Normalmente, o cérebro utiliza quase que exclusivamente a glicose para suprir sua demanda energética. A oxidação da glicose é quase completa, com pouca produção de lactato. Quando a concentração de amônia está aumentada, a produção de lactato e a relação NADH/NAD+ estão aumentadas e o pH do cérebro, diminuído (HINDFELT, 1997). Essas alterações podem ser explicadas por desconexão entre a glicólise e o ciclo dos ácidos tricarboxílicos-(C.A.T.). Dois mecanismos podem explicar essa desconexão: interferência no ciclo malato-aspartato e inibição do complexo dehidrogenase do α-cetoglutarato. As perturbações metabólicas decorrentes do bloqueio do C.A.T. são agravadas pelo estímulo da glicólise também observado na encefalopatia hepática.
Interferência no ciclo malato-aspartato - Parece resultar da
diminuição de glutamato nos neurônios. Vários estudos mostraram que o mesmo está diminuído nas síndromes hiperamoniêmicas (COOPER & PLUM, 1987). Essa
diminuição resultaria da síntese aumentada de glutamina a partir do glutamato e da amônia (HINDFELT et al.. 1997) A queda de glutamato nos mitocondrios leva a diminuição na produção de aspartato (Reação 1 do quadro 3). A conseqüente diminuição da passagem de aspartato para o citoplasma diminui sua transformação em oxaloacetato (reação 2 do quadro 3) e portanto na produção de malato (reação 3 da figura x) e na sua passagem para os mitocôndrios. Assim, há diminuição na redução de NAD para NADH (reação 4 do quadro 3). Esta produção diminuída de NADH leva à diminuição da transferência de H+ para a cadeia respiratória (reação 5 do quadro 3) com a conseqüente diminuição na produção de ATP.
Inibição do complexo α-cetoglutarato dehidrogenase Essa inibição
ocorre pela diminuição da produção de NAD pela diminuição do ciclo malato aspartato
Estímulo da glicólise O excesso de amônia estimularia a
fosfofrutoquinase 1 e, assim a glicólise. Como esta está desconectada do C.A.T. ocorre produção aumentada de lactato, aumento, no citosol da relação NADH para NAD+ e aumento do pH.
Evidentemente, durante uma hiperamonemia moderada os distúrbios no metabolismo energético são discretamente afetados. Todavia, durante a hiperamoniemia grave a produção de ATP a partir do ciclo da glicólise é limitada e não é acompanhada do ritmo diminuído da produção de ATP devido à diminuição do C.A.T. Os fosfatos altamente energéticos declinam com a disfunção cerebral contínua. Várias evidências sugerem que o metabolismo energético cerebral pode adaptar-se por um tempo limitado à intoxicação crônica por amônia (KOSENKO, 1993).
QUADRO 3 - CICLO MALATO ASPARTATO
3) alterações da função dos neurotranmissores
A produção de substâncias neurotóxicas e neuroativas podem levar ao deslocamento de neurotransmissores das terminações pré sinápticas. Os neurotransmissores presentes em excesso na encefalopatia hepática incluem o ácido
γ-aminobutírico (G.A.B.A.), amônia, amino-ácidos e seus produtos (mercaptanas, produtos da transformação do triptofano, a octopamina, derivada dos amino-ácidos aromáticos e fenóis), a serotonina, a histamina e as catecolaminas, glutamato e aspartato, ácidos graxos de cadeia intermediária e fenóis. Estas substâncias estão elevadas no fluído cerebroespinal de pacientes com encefalopatia (BORG, 1982). Estes neurotransmissores atuam como inibidores e estimulantes das ligações sinápticas no cérebro.
Citoplasma
Mitocôndria
NAD NADH Malato Oxalo - acetato MalatoNAD NADH O2 H2O + ATP Cadeia de elétrons Oxalo - acetato Aspartato Glutamato α- Cetoglurato Aspartato α- Cetoglurato Glutamato 1 2 4 5 3
Neurotransmissores G.A.B.A.érgicos.
Existem dois tipos de receptores G.A.B.A.. O tipo A é positivamente modulado pelos barbitúricos (que prolongam o tempo de abertura do canal) e os benzodiazepínicos (drogas usadas como ansiolíticos, que aumentam a frequência com que os canais se abrem, hiperpolarizando sinapses de células inibitórias). O receptor G.A.B.A é formado por várias cadeias, cinco subunidades que revestem o canal por onde passa o Cl-. Cada cadeia é constituída por uma proteína, com seis domínios em α-hélice no interior da membrana. Barbitúricos e benzodiazepínicos se ligam a centros ativos diferentes do receptor, os primeiros no interior da membrana e o segundo na porção extracelular do receptor (RAW & HO, 2000). Os receptores de G.A.B.A no cérebro estão ligados a um canal de cloro que, aberto, permite o influxo de íons cloreto dentro do neurônio causando polarização do neurônio pós sináptico (WONG, 1993). Os benzodiazepínicos aumentam a resposta do canal de cloreto controlado pelo G.A.B.A. ao G.A.B.A.
Postulou-se que o G.A.B.A, o principal neurotransmissor inibidor, derivado da medula óssea, acumular-se-ia no sangue, atravessaria a barreira hemato- encefálica e atuaria nos receptores pós sinápticos do G.A.B.A. Não existem evidências convincentes de que o excesso de G.A.B.A por si só seja diretamente responsável pela encefalopatia hepática (MORONI, 1987). Concentrações de GABA no fluído cerebroespinal e no plasma não se correlacionam com a clínica ou gravidade das alterações no E.E.G. na encefalopatia hepática de pacientes com cirrose. Os benzodiazepínicos exercem seus efeitos no sistema nervoso central interagindo com sítios de ligação de alta afinidade no complexo receptor de G.A.B.A- benzodiazepínicos (BUTTERWORTH, 1992). Estimulantes endógenos anormais dos receptores de benzodiazepínicos seriam originados no intestino (ou por estarem presentes em vegetais da dieta ou por síntese pelas bactérias intestinais) não seriam desintoxicados no fígado lesado-o extensamente (BASILE, 1991). Há muitas evidências (BASILE,1991a; BAKTI, 1987; BASILE, 1991b) de que o aumento em sua concentração ou em sua disponibilidade contribuam para a encefalopatia hepática – antagonistas dos receptores benzodiazepínicos como o fumazenil revertem as
anormalidades neurológicas e do E.E.G. em animais e humanos com encefalopatia hepática (BANSKY,1989). Em particular o N-desmetyldiazepam tem sido isolados no soro, fluído espinal e cérebro de pacientes com falência hepática (BASILE, 1990: BASILE 1991a)
Transmissores Dopaminérgicos
A noradrenalina e a dopamina são neurotransmissores importantes no cérebro. Os falsos neurotransmissores incluem o G.A.B.A., a octopamina, a histamina, a serotonina, a feniletanolamina. Algumas destas substâncias são sintetizadas a partir da tirosina e tiramina. Estas substâncias competem com o neurotransmissor normal catecolamina, deslocando-o, e desta forma prejudicando a neurotransmissão dopaminérgica no cérebro de pacientes com encefalopatia hepática (FISCHER, 1971). Níveis elevados de prolactina em pacientes com cirrose e encefalopatia hepática tem sido documentada e pode refletir um baixo nível de dopamina.
Desequilíbrio entre Aminoácidos Aromáticos e Aminoácidos de Cadeia Ramificada
Os pacientes com cirrose apresentam desequilíbrio nos níveis do cérebro e plasma de metionina e aminoácidos aromáticos - (A.A.A.) fenilalanina, tirosina e triptofano comparada com aminoácidos de cadeia ramificada - (A.A.C.R.) - leucina, isoleucina e valina. A relação entre A.A.A. e A.A.C.R. correlaciona-se com a gravidade das mudanças histológicas no fígado e não com o grau da encefalopatia. Esse desequilíbrio pode, em parte, ser explicado pelo desequilíbrio entre insulina e glucagon. Como os A.A.A. e os A.A.C.R. competem pelos mesmos transportadores da barreira hemato-encefálica, a captação de A.A.A. aumenta, promovendo a síntese de falsos neurotransmissores (octopamina e feniletanolamina), os quais competem com a noradrenalina edopamina endógenas (FISCHER,1971).
Ácidos Graxos e Serotonina
O fígado normal metaboliza ácidos graxos absorvidos no intestino. Assim na insuficiência hepática seus níveis estão elevados no sangue e no cérebro. Entretanto, o papel exato dos ácidos graxos na encefalopatia hepática é desconhecido. Em modelos animais, ácidos graxos de cadeia curta (butírico, valérico ou capróico) diminuem a atividade cerebral. Altas concentrações de ácidos graxos de cadeia curta têm sido detectadas na encefalopatia hepática; entretanto, o nível de ácidos graxos não se correlaciona com a gravidade da encefalopatia (ZIEVE, 1981). Os ácidos graxos podem inibir a atividade da ATPase dependente de sódio e de potássio nos microssomos cérebrais. Também, ácidos graxos de cadeia longa deslocam triptofano da albumina, aumentando o nível de triptofano livre o que leva a síntese aumentada de serotonina, um conhecido depressor da consciência. A renovação da serotonina cerebral está aumentada na encefalopatia hepática; entretanto não se sabe se está associada com um aumento da função serotoninérgica (MARDINI, 1993).
Mercaptanas
Mercaptanas (metanotiol e dimetildissulfito) são formados a partir de aminoácidos que contenham enxôfre. São neurotóxicos e o metanotiol pode potencializar a toxicidade da amônia (ZIEVE, 1974).
Permeabilidade da Barreira Hemato-Encefálica
As alterações da barreira hemato-encefálica podem existir na encefalopatia hepática; entretanto este não é um distúrbio generalizado (KNUDSEN, 1993). Esta permeabilidade aumentada pode permitir o acesso de substâncias tóxicas ao cérebro. As alterações na permeabilidade hemato-encefálica são uma possível consequência da hiperamoniemia secundária a cirrose hepática (GRIPPON, 1986). O aumento de aminoácidos neutros que atravessam a barreira tem sido observado na encefalopatia hepática.
A importância de uma ligação entre os distúrbios metabólicos e sistemas de transporte indicam a patogênese multifatorial da encefalopatia hepática.
A Vitamina A intraperitoneal diminui a lesão hepática, o nível de aminotransferase séricas e a concentração de bilirrubina não conjugada em ratos com obstrução do ducto biliar comum (KARAN, 1996). Esse afeito pode ser devido à sua ação antioxidante (SENOO & WAKE, 1985; AYDEMIR et al., 2000; DAWSON, 2000). Portanto, o efeito protetor contra a mortalidade no nosso experimento pode ser devido à ação anti-oxidante da vitamina A que exerce essa função pois sua forma hidromiscível facilita sua absorção na colestase.
MORTALIDADE APÓS PENTOBARBITAL
A vitamina A hidrossolúvel diminuiu a mortalidade por pentobarbital em ratos jovens com colestase obstrutiva - a mortalidade após 0,5 mg/g de pentobarbital por via intraperitoneal no grupo LA0 foi de 100%, de 17% no grupo LA50 e de 9,1%.no grupo LA100.
A capacidade de desintoxicação hepática está diminuída na colestase. O efeito protetor da vitamina A pode ser devido à modulação, pela vitamina A, da atividade de desintoxicação do pentobarbital através do sistema enzimático relacionado ao citocromo P450. As enzimas relacionadas ao citocromo P450 são responsáveis pela ativação e desintoxicação de endobióticos ou xenobióticos (CONNEY, 1967). A vitamina A é um dos fatores que podem modificar este sistema enzimático em ratos. Vários estudos tem demonstrado que a deficiência de vitamina A reduziu o peso do fígado, o conteúdo e a atividade das enzimas relacionadas ao citocromo P450 (GUPTA, 1989). Por outro lado, quando os animais foram alimentados com dieta suplementada com vitamina A a atividade das isoenzimas do citocromo P450 aumentaram (MURRAY, 1981). A lesão hepatocítica da colestase induzida pela ligadura do ducto biliar leva a diminuição destas isoenzimas do citocromo P-450 (TATHEISHI, 1998) e afetam diretamente o
metabolismo de certas drogas além de contribuir para a diminuição do clearence hepático destas na doença hepática grave.
A ação hepatoprotetora da vitamina A, na colestase, se deve à sua ação antioxidante, eliminando espécies reativas de oxigênio e, assim à consequente proteção de estruturas celulares contra o efeito necrotizante ou apoptótico dos ácidos biliares (DRISKEL, l995).
FIBROSE
Nossos resultados mostraram que os ratos com colestase que receberam a vitamina A, nos níveis A50 e A100 apresentaram menor intensidade de fibrose que a do grupo com colestase que não recebeu a vitamina - LA0. Nos grupos controles que receberam a vitamina A (SA50 e SA100) não houve ocorrência de fibrose. A vitamina A protege, no modelo estudado, o fígado das lesões da colestase. Nas doses empregadas a vitamina A não causou fibrose (não houve diferença estatísticamente significativa entre os grupos SA0, AS 50 e SA100).
As células estreladas perisinusoidais têm, ao mesmo tempo, a capacidade de armazenar vitamina A e de se transformar em miofibroblastos (WISSE et al., 1996). Cerca de 80 a 90% dos retinóides na forma de ésteres de retinil do organismo, estão armazenados no citoplasma destas células em gotículas de gordura. As células estreladas são a fonte primária da matriz extra-celular, não somente em fígados normais (WAKE,1980) mas também em fígados doentes. Na intoxicação pela vitamina A, hipertrofia, proliferação de células estreladas e transformação em células semelhantes aos miofibroblastos podem levar à hipertensão portal não cirrótica, fibrose e cirrose (HAUTEKEETE, 1997). Uma redução do retinol hepático em processos fibróticos do fígado associa-se a acúmulo da matriz extra-celular, a redução dos lipídios das células estreladas e a transformação de células estreladas em miofibroblastos ativos (BLOMHOFF et al., 1991). Esse acúmulo da matriz extra- celular decorre de sua síntese por diferentes tipos de células hepáticas (FRIEDMAN, 1999), estimuladas por diferentes polipeptídeos liberados principalmente por
linfócitos e macrófagos. (ver acima ítem 1.6.2.3). Dentre aquelas células hepáticas, as células estreladas são consideradas as principais produtoras de matriz extra-celular na fibrose hepática (PINZANI, 1995); Na lesão hepática crônica as células estreladas se diferenciam em células semelhantes aos miofibroblastos com marcada expressão para α actina de musculatura lisa e ocasionalmente expressão para desmina. A diferenciação é gradual, ocorrendo um estágio intermediário no qual elas são chamadas de “células de transição” e é regulada por uma intrincada cadeia de comunicação destas células com as células de Küpffer ativadas (macrófagos hepáticos), hepatócitos danificados, plaquetas, células inflamatórias e endoteliais, envolvendo citoquinas e mediadores não peptídeos, tais como espécies de oxigênio reativo, eicosanóides e acetaldeído (HAUTEKEETE, 1997; KAWADA, 1997). Na colestase experimental, as células estreladas são ativadas em miofibroblastos por ação das fibronectinas (em especial a fibronectina EIIIA) liberadas rapidamente pelas