4.2.2.1 Espectroscopia de UV-visível
Os espectros de absorção das AuNP (concentração final = 5 nM) e dos bionanoconjugados a pH 11 foram efectuados num espectrofotómetro UV-visível, modelo UV2, UNICAM, em células de quartzo (Hellma, Alemanha), à temperatura ambiente, num intervalo de comprimento de onda de 300 a 900 nm.
Parte II. Interacção de Proteínas com Nanopartículas de Ouro
76 4.2.2.2 Espectroscopia de Dicroísmo Circular (CD)
As experiências de dicroísmo circular foram efectuadas num espectropolarímetro Jasco-810, à temperatura controlada de 25 °C (controlador de temperatura, Julabo) e num intervalo de comprimento de onda de 195 a 260 nm. As amostras (concentração final de AuNP = 12 nM) a pH 10 foram medidas numa cuvete de quartzo (Hellma, Alemanha) de 1 mm de espessura, com uma velocidade de 20 nm min-1, um intervalo entre amostras de 0,1 nm e um tempo de resposta de 16 s.
A análise dos espectros de CD foi realizada online, usando o programa DICHROWEB
(www.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html/home.html) com o algoritmo de determinação de estrutura
secundária CDSSTR2 [31, 32]. Os resultados foram expressos em elipticidade média por resíduo de aminoácido, (Θ), em deg cm2 dmol-1 a 222 nm, sendo os espectros seleccionados
os que apresentaram menor razão sinal-ruído. As experiências de CD foram efectuadas no Laboratório de Patologia Molecular do Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz, Monte de Caparica.
4.2.2.3 Microscopia de Força Atómica (AFM)
Para os ensaios de AFM as amostras de AuNP e de bionanoconjugados foram centrifugadas durante 25 min. a 9300 rpm (centrífuga 5810R, Eppendorf), seguido da remoção do sobrenadante. O precipitado foi lavado duas vezes com 100 µL de água para biologia molecular (Sigma-Aldrich), e ressuspendido em 60 µL da mesma água, para eliminar cristais de sal e/ou tampão que poderiam afectar as medidas de AFM.
Pipetaram-se 20 µL da amostra para uma mica clivada e deixou-se secar à temperatura ambiente. As imagens foram obtidas com um microscópio de força atómica, Multimode (Veeco), equipado com um controlador Nanoscope IVa.
A AFM foi operada a temperatura ambiente e ao ar, no modo intermitente (“tapping”). Utilizaram-se pontas de silício montadas em braços (“cantilevers”) rectangulares
Capítulo 4. Formação de Bionanoconjugados Citocromo c - Nanopartículas de Ouro
77 com uma frequência de ressonância de cerca de 300 kHz (AppNano, CA) e as imagens foram seleccionadas com base num conjunto de medidas estáveis e reprodutíveis.
As imagens de AFM foram obtidas pelo Doutor Peter Eaton no REQUIMTE/Departamento de Química da Faculdade de Ciências da Universidade do Porto.
4.2.2.4 Microscopia Electrónica de Transmissão (TEM)
Depositaram-se 20 µL da amostra numa matriz de cobre revestida a carbono e secou-se à temperatura ambiente. As imagens de TEM foram obtidas num microscópio HITACHI H-8100, operado com uma voltagem de aceleração de 200 kV e analisadas com o utilitário ImageJ e Origin Pro 8.0, sendo apresentadas as imagens representativas de um conjunto de medidas estáveis e reprodutíveis.
Este trabalho foi realizado pelo Dr. Pedro Quaresma no MicroLab - Laboratório de Microscopia Electrónica do Instituto Superior Técnico, Universidade Técnica de Lisboa.
4.2.3 Medidas de Dispersão de Luz
As medidas de dispersão de luz dinâmica (DLS) e de potencial zeta (ζ-potencial) foram realizadas usando um Zetasizer Nano-ZS da Malvern Instruments, com um laser de He-Ne (comprimento de onda = 633 nm) a 4 mW e com um ângulo fixo de detecção de 173°, para DLS, e de 17°, para as medidas de potencial zeta. Todas as medidas foram obtidas à temperatura controlada de 25 °C e tiveram início 15 min. após a amostra atingir o equilíbrio térmico. As medidas foram repetidas para se poder estimar o erro associado.
Este estudo foi desenvolvido na Unidade de Biomembranas do Instituto de Medicina Molecular da Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa.
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78 4.2.3.1 Medidas de Dispersão de Luz Dinâmica (DLS)
Filtrou-se 1 mL da amostra a pH 11, previamente diluída em água ultra-pura (sistema de água Milli-Q, Millipore, 18,2 MΩ.cm) numa seringa estéril (concentração final de AuNP aproximadamente de 0,3 nM e concentração de Cyt c variável de acordo com a razão desejada), através de um filtro de nylon de 0,45 µm de diâmetro de poro (Whatman) para uma cuvete descartável com tampa (poliestireno, tamanho 10 x 10 x 48 mm, Sarsted,
Alemanha) e agitou-se. Mediu-se a absorvância da amostra ao comprimento de onda de 633 nm. Efectuaram-se medições de DLS 15 vezes em cada amostra e em cada medida foram
realizadas de 13 a 45 aquisições.
Pelo utilitário da Malvern (incorporado no equipamento), a função de auto- correlação da intensidade de luz dispersa foi analisada pelo programa CONTIN (transformação inversa de Laplace [33, 34]), e o diâmetro hidrodinâmico, d (H), foi calculado usando a equação de Stokes-Einstein (equação 1):
H 3 T 1
d (H) descreve o diâmetro hidrodinâmico, D o coeficiente de difusão translacional, k a constante de
Boltzman, T a temperatura absoluta e η a viscosidade.
4.2.3.2 Medidas de Potencial Zeta (ζ-potencial)
Filtrou-se 1 mL da amostra a pH 11, previamente diluída em água ultra-pura numa seringa estéril (concentração final de AuNP aproximadamente de 3 nM e concentração de Cyt c variável de acordo com a razão desejada), através de um filtro de nylon de 0,45 µm de diâmetro de poro (Whatman), transferiu-se lentamente para uma célula limpa de potencial zeta (poliestireno com eléctrodos metálicos revestidos a ouro, Malvern, UK), de forma a garantir que a amostra não possui bolhas de ar dentro da célula e que os eléctrodos estão completamente imersos quando da colocação das tampas nas extremidades, e por último foram colocadas as placas de contacto térmico (proporcionam uma maior estabilidade da
Capítulo 4. Formação de Bionanoconjugados Citocromo c - Nanopartículas de Ouro
79 ζ
temperatura). Cada amostra foi medida 25 vezes e em cada medida foram realizadas 65 aquisições.
O valor de potencial zeta foi calculado pelo utilitário da Malvern através da equação de Henry (equação 2), que relaciona a mobilidade electroforética com o ζ−potencial.
E 2
UE é a mobilidade electroforética, ε e η são a constante dieléctrica e a viscosidade do solvente,
respectivamente, ζ é o potencial zeta e f(kR) a função de Henry.
A função de Henry foi aproximada pela aproximação de Smoluchowski, f(kR) = 1,5, devido ao facto das medidas de potencial zeta terem sido realizadas em solução aquosa.
Os dados obtidos para as diferentes razões [Cyt c] / [AuNP] foram ajustados a uma isotérmica de adsorção de Langmuir, usando o utilitário Origin Pro 8.0.