O potencial zeta mede o potencial eléctrico à superfície dos bionanoconjugados. A grandeza deste potencial de superfície está relacionada com a carga da superfície e a espessura da dupla camada, dependendo assim da quantidade de proteína (considerada como um polímero carregado) adsorvida à superfície do bionanoconjugado. É esperado que com o aumento da concentração de Cyt c, a carga de superfície aumente até atingir um valor estável quando deixar de ser possível adsorver mais proteína ao bionanoconjugado. O mesmo se verificou noutros trabalhos de investigação apresentados na literatura, referentes à adsorção de proteínas em partículas de cerâmica [37] e determinação da superfície de cobertura de pontos quânticos (“quantum dots”) pela enzima P450 [36].
Para se medir os valores de potencial zeta, as soluções de AuNP e de bionanoconjugados foram preparadas como descrito no procedimento experimental. Incubaram-se concentrações crescentes de ambos os citocromos com a mesma concentração de AuNP, ocorrendo assim um aumento sucessivo da razão, até 500 moléculas de proteína por AuNP, à temperatura constante de 25 °C.
A solução de AuNP apresentou um potencial zeta de -49,0 ± 4,2 mV, concordante com o apresentado na literatura [3].
Para os bionanoconjugados HCc-AuNP, o potencial zeta aumenta até à razão [HCc] / [AuNP] de 200, apresentando um valor de potencial de -30,5 mV ± 1,1 mV, que se mantêm com valores aproximados nas razões mais elevadas, como ilustra a figura 4.4.
Parte II. Interacção de Proteínas com Nanopartículas de Ouro 84 0 100 200 300 400 500 -55 -50 -45 -40 -35 -30 -25 Po ten cia l Z eta ( m V ) [HCc] / [AuNP]
Figura 4.4 Potencial Zeta dos bionanoconjugados HCc-AuNP em função da razão [HCc] / [AuNP] a pH 11. Cada ponto é uma média de experiências em triplicado e as barras de erro representam o desvio
padrão médio. A linha preta representa o ajuste a uma isotérmica de adsorção de Langmuir (equação 3).
O potencial zeta dos bionanoconjugados HCc-AuNP é cerca de 20 mV menos negativo do que o obtido para a solução de AuNP, o que parece indicar que o HCc transmite carga de superfície mais positiva às AuNP.
O mesmo se verifica para os bionanoconjugados YCc-AuNP, em que o potencial zeta aumenta até atingir o valor de -35,3 mV ± 2,4 mV à razão [YCc] / [AuNP] de 200, mantendo um valor praticamente constante a partir desta razão (figura 4.5).
As proteínas em solução apresentaram um potencial zeta próximo de 0 mV (-0,30 ± 1,4 mV) para YCc e -14,3 mV ± 1,6 mV para HCc. Estes valores de potencial zeta foram obtidos a duas concentrações diferentes de proteína (1,5 e 10 µM), sendo reprodutíveis.
O facto de ambas as proteínas apresentarem valores de potencial zeta próximos de zero, pode ser explicado pelas medidas terem sido realizadas a pH 11.
Este pH é próximo do ponto isoeléctrico (pI) de ambas as proteínas (pI = 9,6 para o HCc e pI = 9,5 para o YCc, como determinado pelo programa “Compute pI/Mw” do portal ExPASy [38]).
Capítulo 4. Formação de Bionanoconjugados Citocromo c - Nanopartículas de Ouro 85 0 100 200 300 400 500 -55 -50 -45 -40 -35 -30 -25 Pot enci al Zet a ( m V) [YCc] / [AuNP]
Figura 4.5 Potencial Zeta dos bionanoconjugados YCc-AuNP em função da razão [YCc] / [AuNP] a pH 11. Cada ponto é uma média de experiências em triplicado e as barras de erro representam o desvio padrão médio. A linha preta representa o ajuste a uma isotérmica de adsorção de Langmuir (equação 3).
Em estudos de adsorção de proteína à superfície de ouro a temperatura constante, a isotérmica de adsorção de Langmuir pode ser ajustada às alterações de frequência do cristal de quartzo de ouro como função da concentração de proteína [3, 39]. A partir destes resultados, torna-se possível estabelecer para este trabalho um paralelismo entre as alterações de frequência e o potencial zeta, constituindo este uma medida indirecta da adsorção de proteína.
O potencial zeta está relacionado com a carga de superfície da porção de proteína adsorvida à AuNP, os resultados obtidos ilustram que quanto mais proteína adsorve à superfície da nanopartícula, mais o potencial zeta do bionanoconjugado aumenta, até que estabiliza (figuras 4.4 e 4.5), o que corresponde a uma cobertura homogénea da superfície da AuNP pela proteína.
As figuras mostram o potencial zeta para cada bionanoconjugado em função da razão [Cyt c] / [AuNP], sendo os pontos experimentais ajustados pela isotérmica de adsorção de Langmuir, usando a equação 3 no utilitário Origin Pro 8.0. Os parâmetros obtidos para o ajuste dos dados experimentais estão representados na tabela 4.1.
Parte II. Interacção de Proteínas com Nanopartículas de Ouro
86
L
L 3
ζ é o ζ-potencial medido para o bionanoconjugado com a superfície de cobertura R = [Cyt c] /
[AuNP], ζmax é o valor máximo de ζ-potencial e KL é a constante de ligação, que corresponde ao valor
do inverso das razões de concentração (1/R), para metade do ζmax.
Tabela 4.1 Parâmetros de ajuste da isotérmica de adsorção de Langmuir a partir da equação 3, para ambos os bionanoconjugados.
ζmax (mV) KL ζmax.KL (mV)
HCc-AuNP -27,4 ± 2,4 0,025 ± 0,010 -0,69
YCc-AuNP -28,4 ± 3,1 0,011 ± 0,004 -0,31
De acordo com a teoria da isotérmica de adsorção de Langmuir, o ζmax.KL está
relacionado com alterações de entalpia que ocorrem no processo de adsorção [40].
O número efectivo de moléculas de proteína presentes numa camada de proteína pode ser calculado assumindo um empacotamento máximo de proteínas à superfície da nanopartícula de ouro, ou seja, um empacotamento cúbico de face centrada. Assim sendo, foi possível determinar o número de moléculas de citocromo c que teoricamente podem adsorver à superfície da AuNP (consultar apêndice VI).
Foi necessário considerar a adsorção de duas monocamadas para cada bionanoconjugado (correspondendo a 212 moléculas de HCc ou 188 moléculas de YCc por cada AuNP) de modo a explicar a estabilização dos valores de potencial zeta em cerca de 200 moléculas de proteína por cada AuNP.
O ajuste dos dados de potencial zeta pela isotérmica de adsorção de Langmuir assume que a adsorção não excede uma única monocamada, no entanto, foi considerado que a proteína adsorve em 2 monocamadas, propondo-se um modelo dinâmico de adsorção na discussão de resultados.
ζ ζ
Capítulo 4. Formação de Bionanoconjugados Citocromo c - Nanopartículas de Ouro
87 Para se garantir que a carga de superfície dos bionanoconjugados se encontra totalmente estável (estando a AuNP completamente recoberta pela proteína), foram preparados bionanoconjugados com uma razão [Cyt c] / [AuNP] = 250. Na literatura descreve-se uma razão semelhante (200 citocromos por AuNP) [5], com base num estudo espectrofotométrico para a determinação da menor razão de citocromo c necessária para recobrir as AuNP de forma a evitar a agregação induzida por electrólito.