3. Model Building
3.3 Initial (test) simulations
Em geral, as crianças com FL/PNS possuíram maior frequência basal de MN (p < 0,001), PN (p < 0,001) e BN (p < 0,001) em comparação com as do grupo controle (Figura 11). Quando subdivididas de acordo com o tipo de fenda, não houve diferença significativa na frequência dos biomarcadores entre os pacientes com fenda labial, fenda palatina e fenda labiopalatina (Tabela 4).
Tabela 4. Frequência dos biomarcadores do teste do micronúcleo com bloqueio da citocinese (CBMN) segundo o tipo de fissuras em crianças com fendas labiopalatinas não-sindrômicas de Natal/ RN.
Biomarcador do CBMN Tipo de fenda N Mediana (IQR) Valor p
Micronúcleo Fenda labial 11 1.0 (4)
Fenda labiopalatina 24 1.5 (4) 0.644 Fenda palatina 11 2.0 (4)
Ponte nucleoplasmática Fenda labial 11 2.0 (10)
Fenda labiopalatina 24 2.5 (6) 0.989 Fenda palatina 11 4.0 (10)
Broto nuclear Fenda labial 11 2.0 (4)
Fenda labiopalatina 24 2.0 (3) 0.472 Fenda palatina 11 3.0 (7)
Figura 11. Frequência dos biomarcadores de instabilidade genômica pelo teste do micronúcleo com bloqueio da citocinese em crianças com fenda labiopalatina não-sindrômica do Rio Grande do Norte. As setas apontam para um micronúcleo (D), ponte nucleoplasmática (E) e broto nuclear (F) em fotos capturadas com magnificação de 400x a partir do arquivo de lâminas da pesquisadora Luíza Xavier.
Em outra análise, verificou-se que a frequência dos biomarcadores do CBMN não foi modificada de modo significativo quando comparados os indivíduos homozigotos para o alelo selvagem com os heterozigotos e homozigotos para o alelo mutante dos polimorfismos genéticos avaliados (Tabela 5). Este tipo de teste foi o que mostrou melhores resultados dentre outras possibilidades de associação entre os genótipos.
Tabela 5. Frequência dos biomarcadores do teste do micronúcleo com bloqueio da citocinese (CBMN), em função dos polimorfismos genéticos envolvidos no metabolismo do ácido fólico, em pacientes com fenda labiopalatina não-sindrômica de Natal/ RN.
Biomarcador do CBMN Genótipo N Mediana (IQR) Valor p
Micronúcleo MTHFR C677T CC CT + TT 22 26 2.002.00 (4) (6) 0.776 Ponte nucleoplasmática CT + CC TT 22 26 2.004.50 (6) (9) 0.067* Broto nuclear CT + TT CC 22 26 2.002.00 (3) (5) 0.975 Micronúcleo MTHFR A1298C AA AC + CC 22 26 2.002.00 (7) (2) 0.776 Ponte nucleoplasmática AC + CC AA 22 26 2.502.50 (11) (6) 0.668 Broto nuclear AC + CC AA 22 26 2.002.50 (3) (5) 0.397 Micronúcleo MTR A2756G AA AG + GG 27 21 2.002.00 (3) (5) 0.554 Ponte nucleoplasmática AG + GG AA 27 21 3.002.00 (9) (7) 0.536 Broto nuclear AG + GG AA 27 21 2.002.00 (3) (7) 0.515
Micronúcleo MTRR A66G AA AG + GG 10 38 2.501.50 (4) (5) 0.767 Ponte nucleoplasmática AG + GG AA 10 38 5.002.00 (12) (7) 0.663 Broto nuclear AG + GG AA 10 38 1.502.00 (4) (4) 0.555 Micronúcleo RFC1 A80G AA AG + GG 14 34 0.502.00 (4) (4) 0.131 Ponte nucleoplasmática AG + GG AA 14 34 2.003.00 (7) (9) 0.499 Broto nuclear AG + GG AA 14 34 1.003.00 (1) (5) 0.191
IQR, intervalo interquartil. Asterisco representa valor p borderline.
Considerando a frequência dos biomarcadores do CBMN em função dos relatos maternos de consumo de bebidas alcoólicas, hábito de fumar e nos casos de fissuras orais em membros da família, observou-se que não houve diferença estatística significativa entre os casos negativos e afirmativos de cada uma dessas variáveis (Tabela 6).
Tabela 6. Frequência dos biomarcadores do teste do micronúcleo com bloqueio da citocinese (CBMN) em função de variáveis epidemiológicas em pacientes com fenda labiopalatina não-sindrômica de Natal/ RN.
Biomarcador do CBMN
Variável
epidemiológica N Mediana (IQR) Valor p Ingestão materna de
bebidas alcoólicas durante a gravidez
Micronúcleo Não 35 1,0 (4) 0,147
Sim 13 3,0 (6)
Ponte nucleoplasmática Não 35 3,0 (10) 0,337
Sim 13 2,0 (6)
Broto nuclear Não 35 2,0 (3) 0,460
Sim 13 2,0 (7)
Hábito materno de fumar durante a gravidez
Micronúcleo Não 39 2,0 (4) 0,925
Sim 9 1,0 (7)
Ponte nucleoplasmática Não 39 3,0 (8) 0,904
Sim 9 2,0 (12)
Broto nuclear Não 39 2,0 (3) 0,165
Sim 9 5,0 (6)
Membros da família com fissuras orais
Micronúcleo Não 31 2,0 (4) 0,904
Sim 17 2,0 (5)
Ponte nucleoplasmática Não 31 2,0 (7) 0,207
Sim 17 5,0 (14)
Broto nuclear Não 31 2,0 (5) 0,439
Sim 17 2,0 (5)
Segundo o modelo de regressão logística binária (Tabela 7), a frequência de micronúcleos foi significante estatisticamente (p = 0,043) para a previsão do fenótipo das fissuras orais na amostra estudada. Crianças com FL/PNS apresentaram 2,3 vezes mais risco de possuir altas frequências de MN em comparação com crianças do grupo controle. De um modo geral, este modelo revelou que os biomarcadores (X2 = 31,6; p < 0.001) foram significativos para a previsão da variável resposta (fenótipo fenda), e eles foram responsáveis por 55,2% (Nagelkerke R2) da variância na amostra. A probabilidade de classificar corretamente em qual grupo cada criança pertencia foi de 81,8%.
Tabela 7. Previsão do fenótipo das fissuras orais dependendo dos biomarcadores de instabilidade do genoma segundo o modelo de regressão logística binária.
Biomarcador de
instabilidade do genoma Exp(B) Erro padrão Valor p
Micronúcleo 2,310 0,415 0,043*
Ponte nucleoplasmática 1,424 0,232 0,127
Broto nuclear 2,011 0,387 0,071
Exp(B) expressa o equivalente à razão de chance (odds ratio). Asterisco representa significância estatística.
Além disso, 12 indivíduos fissurados (2,5% do grupo) apresentaram, em frequência muito baixa, linfócitos com anomalias nucleares sugestivas das morfologias denominadas “fusão”, “circular” e “ferradura” (Figura 12) descritas recentemente por Bull et al (2012).
Dentro desta categoria particular de indivíduos (Tabela 8), 5 pacientes exibiram frequência de MN superiores à mediana do grupo geral dos fissurados (2,0 MN/ 1000 células binucleadas); 6 indivíduos apresentaram frequência de PN superiores à mediana do grupo geral dos fissurados (2,5 MN/ 1000 células binucleadas), e 8 crianças exibiram frequência de BN superiores à mediana do grupo geral dos fissurados (2,0 BN/ 1000 células binucleadas).
Tabela 8. Frequência dos biomarcadores novos (colunas 2 a 4) e clássicos (colunas 5 a 7) do teste do micronúcleo com bloqueio da citocinese em indivíduos com fenda labiopalatina não-sindrômica do Rio Grande do Norte.
Paciente fissurado Fusão nuclear Núcleo circular Núcleo em ferradura Micronúcleo Ponte nucleoplasmática Broto nuclear 1 0 0 1 1 14 8 2 2 0 0 18 9 16 3 0 0 1 1 18 3 4 1 0 1 4 1 0 5 1 0 0 5 0 0 6 1 0 0 7 0 6 7 0 0 1 0 6 2 8 0 0 1 0 10 6 9 1 0 0 10 0 10 10 0 0 1 1 3 0 11 0 1 2 1 1 10 12 0 0 1 1 0 3
Figura 12. Novas anomalias nucleares, denominadas “núcleo circular” (A) e “núcleo em ferradura” (B), contabilizadas no teste do micronúcleo com bloqueio da citocinese realizado com amostras de crianças com fenda labiopalatinas nãos-sindrômica. Fotos capturadas em magnificação de 400X, a partir do arquivo de lâminas da pesquisadora Luíza Xavier.
4 DISCUSSÃO
As fissuras orais constituem uma das malformações congênitas mais comumente relatadas na literatura, na qual atentando para os casos não sindrômicos, ainda são aplicados grandes esforços na investigação de quais genes estão diretamente relacionados ao desenvolvimento dessas fissuras, levando em consideração as interações com fatores ambientais. Além disso, ainda são inexistentes os estudos citogenéticos a respeito da população afetada pelas FL/PNS no estado do RN, Brasil.
Os dados epidemiológicos referentes ao tipo de fissura oral dos indivíduos arrolados neste estudo estão semelhantes com o observado por Cardoso et al (2013), os quais avaliaram uma amostra de crianças afetadas pela FL/PNS também residentes no RN e que igualmente foram atendidas no HOSPED. Eles encontraram uma prevalência de 61% das fendas labiopalatinas (71,6% masculino e 28,4% feminino), 22% das fendas palatinas (60% feminino e 40% masculino), e 17% das fendas labiais (68% masculino e 32% feminino). No presente trabalho foi encontrado uma prevalência similar, em que as fendas labiopalatinas afetaram 52,2% das crianças (70,8% do sexo masculino e 29,2% feminino), seguida das fendas palatinas com 23,9% (54,5% masculino e 45,5% feminino), e igualmente 23,9% foram as fendas labiais (72,2% masculino e 27,3% feminino).
Em um estudo realizado por Takano et al (2008) com pacientes do Centro de Atenção aos Defeitos da Face (CADEFI) do Instituto Materno Infantil Professor Fernando Figueira (IMIP), localizado em Recife/ PE, também se observou uma maior prevalência das fendas labiopalatinas (48,6%), seguida da fenda palatina isolada (24,6%).
A ocorrência deste defeito congênito apresenta maior prevalência no sexo masculino segundo dados obtidos em diversos estudos, tanto brasileiros (Cerqueira et al, 2005; Nunes et al, 2007; Coutinho et al, 2009; Martelli et al, 2012), quanto de outros países (Shaw et al, 2006; Honein et al, 2007). Na presente pesquisa também foi encontrado este padrão, no qual 68,8% dos indivíduos com FL/PNS eram meninos.
Esta diferença na taxa de prevalência das FL/PNS entre os sexos ainda não é muito bem esclarecida. A herança mais aceita desta malformação congênita é o modelo multifatorial com limiar, o qual estima que quando indivíduos do gênero menos provável possuírem o fenótipo em questão, eles terão maior chance de gerar descendentes afetados (Grosen et al, 2010).
Ponderando que as FL/PNS apresentam uma etiologia heterogênea que engloba tanto fatores genéticos como ambientais, a exposição materna ao álcool e o hábito do tabagismo durante o primeiro trimestre da gravidez é apontada como fatores ambientais relevantes para o feto desenvolver estas fissuras (Bille et al, 2007; Honein et al, 2007; Hackshaw et al, 2011). Um trabalho realizado por Deroo et al (2008), na Noruega, observou que, em comparação com as mães que relataram nenhum episódio de bebidas alcoólicas, aquelas que relataram ter consumido cinco ou mais unidades (drinks) por mês durante o primeiro trimestre tiveram risco aumentado de 2 a 4 vezes de ter filhos afetados pelas fendas orofaciais.
O álcool é uma substância já documentada na literatura como exercendo efeitos teratogênicos, os quais resultam em uma ampla variação de disfunções, tanto neurocomportamentais quanto alterações anatômicas, denominadas espectro de distúrbios alcoólicos fetais (Fetal Alcohol Spectrum Disorders) (Jones, 2011; Feldman et al, 2012). Esta substância afeta principalmente as células do embrião
em desenvolvimento que originarão o sistema nervoso e as estruturas formadoras da face por meio do aumento do estresse oxidativo e da indução excessiva de morte celular pela via das caspases (Goodlett et al, 2005).
Além disso, também é documentado na literatura que o etanol é capaz de causar danos no DNA, tanto por efeitos clastogênicos quanto aneugênicos (Kayani e Parry, 2010) e, portanto, aumentam a frequência de micronúcleos em indivíduos que consomem bebidas alcoólicas (Maffei et al, 2000; Ishikawa et al, 2006). Sendo que estes efeitos dependem de certas variáveis, como dose e tempo de exposição, e são modulados pela predisposição genética representada pelos SNP associados a enzimas metabolizadoras do álcool (Ishikawa et al, 2006; Haycock, 2009).
Com as informações coletadas no presente trabalho, não foi possível verificar diferenças significativas na frequência basal dos biomarcadores do CBMN dos fissurados com o hábito materno de ingestão de álcool durante a gravidez. Mas devido a limitações no tipo de estudo desenhado para esta pesquisa, não se deve descartar a associação desta variável com o risco de desenvolvimento de FL/PNS, devido ao expressivo impacto desta substância no desenvolvimento embrionário.
Considerando um estilo de vida materno associado ao tabagismo como fator ambiental no desenvolvimento de fissuras orais, um estudo norueguês realizado por Lie et al (2008) verificou que 42% das mães que geraram filhos fissurados eram fumantes, e o risco de ter uma criança com fenda labial aumentou de 1,6 vezes em fumantes passivas a quase 2 vezes em mães que fumaram mais de dez cigarros por dia. Nesse estudo também se verificou que não houve associação significativa entre o hábito de fumar, SNP relacionados com enzimas metabolizadoras das substâncias contidas no cigarro, e a geração de crianças com fissuras orais.
Vários estudos na literatura demonstram que o tabaco possui efeitos genotóxicos e carcinogênicos (Iarc, 2009). A fumaça do cigarro é capaz de aumentar a frequência de alterações cromossômicas e de micronúcleos em células da mucosa bucal e em linfócitos de fumantes ativos e passivos em comparação com indivíduos não-fumantes (Chandirasekar et al, 2011). Contudo, os mecanismos biológicos que suportam causalidade do tabagismo com o desenvolvimento de fendas orais ainda não estão bem elucidados.
A falta de significância estatística entre a associação do hábito de fumar materno e frequência de MN nos pacientes fissurados observados na presente pesquisa pode ser atribuída a limitações nas informações obtidas. Esta observação não exclui as possibilidades dos danos decorrentes do fumo afetar o desenvolvimento das fendas, pois pesquisas indicam que há relações de interação dos efeitos tóxicos do fumo de tabaco com genes associados às FL/PNS, como o IRF6 (Pedersen et al, 2009; Wu et al, 2010; Beaty et al, 2013).
A busca por indivíduos com fissuras orais na família é outro aspecto importante na investigação de prováveis causas no desenvolvimento das FL/PNS, uma vez que mesmo com pais não afetados, o risco de recorrência entre parentes de segundo e terceiro grau ainda é elevado em relação com a população sem histórico para esta malformação congênita (Grosen et al, 2010).
Investigações citogenéticas e moleculares relatadas na literatura apresentam casos de FL/PNS recorrentes em famílias devido à herança de microdeleções ou duplicações de regiões cromossômicas associadas ao desenvolvimento das fendas, pois eram alterações que afetavam genes importantes (TGF-β, por exemplo) na regulação da morfogênese facial (Osoegawa et al, 2007; Shi et al, 2009).
No presente estudo, observou-se que 35,4% dos responsáveis entrevistados alegaram ter algum parente com fenda labial e/ou palatina. Outros estudos na literatura reportam frequências similares, como Baroneza et al (2005), os quais observaram casos afirmativos de histórico familiar para fendas em uma frequência de 26% na amostra estudada em Londrina, no estado do Pará.
Além disso, não foram observadas diferenças significativas nas frequências dos biomarcadores do CBMN dos pacientes fissurados em relação aos casos negativos e afirmativos do histórico familiar para fissuras orofaciais. Entretanto, justamente por não estar associada a nenhuma síndrome conhecida, seria necessário mais informações além das coletadas e testadas neste estudo para de fato aceitar, com menos incertezas, que um componente genético herdado da família não estaria envolvido no desenvolvimento deste defeito congênito.
Além de todas estas variáveis, outro fator genético cabível de investigação no grupo de pacientes fissurados diz respeito à instabilidade genômica. Nesta pesquisa, este parâmetro biológico foi quantificado e analisado pelo método do CBMN, cuja execução no contexto destes pacientes não fora documentado na literatura até o presente momento, segundo a revisão feita para este trabalho.
Avaliou-se também a relação dos biomarcadores do CBMN com aspectos genéticos do metabolismo do ácido fólico, uma vitamina que é associada à manutenção da integridade do genoma, uma vez que participa na síntese de novo de nucleotídeos, contribuindo para o reparo e metilação do DNA. O folato tem sido o foco de pesquisas envolvendo FL/PNS ao longo dos anos (Shaw et al, 1995; Bailey e Berry, 2005; Badovinac et al, 2007; Kelly et al, 2012). Porém, ainda falta investigar as consequências dos SNP relacionados ao metabolismo deste micronutriente com a instabilidade genômica e a geração das fissuras orais.
Sendo assim, neste estudo se verificou que os diferentes genótipos derivados dos SNP do metabolismo do folato não modificaram significativamente os biomarcadores de instabilidade do genoma. Esta falta de associação também foi observada em outras pesquisas. Botto et al (2003) não encontraram associação significativa entre a frequência de MN e os SNP MTHFR A1298C e MTRR A66G em 68 pacientes apresentando doenças coronárias. Já em uma pesquisa com indivíduos australianos considerados saudáveis, os polimorfismos no MTHFR C677T, A1298C e MTRR A66G também não apresentaram efeitos significativos na frequência de MN, sendo esta afetada somente pela interação entre os genótipos do RFC1 A80G e MTR A2756C nesta população estudada (Dhillon et al, 2009).
Em contrapartida, outros estudos apontam que o SNP da MTHFR C677T modula a frequência dos biomarcadores do CBMN. Por exemplo, Leopardi et al (2006) encontrou associação entre o alelo 677T deste gene com um aumento na frequência de pontes nucleoplasmáticas. No presente trabalho, este efeito também foi observado, embora não tenha alcançado um valor estatístico considerado significativo, representando um efeito borderline na amostra analisada. Pelo exposto, percebem-se resultados ainda conflitantes reportados na literatura a respeito da associação dos biomarcadores do CBMN com SNP do metabolismo do ácido fólico.
Ademais, foi notável o fato detectado neste estudo de que pacientes fissurados jovens, independentemente do tipo de fenda que exibiam, possuíram uma alta taxa basal de biomarcadores do CBMN, alcançando uma frequência mediana de 2,5. Inclusive, outros trabalhos da literatura oriundos tanto de outras regiões do Brasil como de outros países também reportam que a frequência basal destes biomarcadores em crianças controle não passa de 2,0 (Minicucci et al, 2008; Cakmak Demircigil et al, 2011; Gajski et al, 2013).
Estes resultados indicam que outros fatores genéticos envolvidos mais diretamente na função de reparo do DNA podem estar contribuindo para o aumento da instabilidade genômica, uma vez que MN, PN e BN alcançaram padrões de frequência basal elevados nas células dos indivíduos fissurados, e estas alterações nucleares indicam falhas de correção das lesões ocorridas no DNA (Dhillon et al, 2011).
O primeiro estudo que investigou esta questão foi publicado por Olshan et al (2005), os quais avaliaram o risco de desenvolver fissuras orais dependendo de SNP em alguns genes representativos dos sistemas de reparo do DNA. Estes autores concluíram que polimorfismos em único nucleotídeo nos genes hOGG1 (Ser326Cys) e XRCC3 (Thr241Met), os quais favorecem um reparo efetivo a partir da excisão de bases e na ocorrência de quebra da dupla fita do DNA, respectivamente, diminuíam o risco das crianças apresentarem fendas orofaciais.
Somente quase dez anos depois que esta perspectiva foi explorada novamente, e desta vez com mais profundidade por Kobayashi et al (2013). A partir de células-tronco da polpa dentária de pacientes fissurados brasileiros, os autores verificaram uma desregulação transcricional em uma extensa rede de genes, com um nódulo central ocupado pelo BRCA1 e seus cooperadores. O gene supressor de tumor BRCA1 é responsável pelo reparo de danos ao DNA pela via de recombinação homóloga dependente de RAD51/RPA, regula a formação do fuso mitótico e participa da manutenção da estabilidade cromossômica durante a mitose (Durant e Nickoloff, 2005; Shang et al, 2014).
O trabalho de Kobayashi e colaboradores demonstrou que as células dos pacientes analisados apresentavam uma resposta prejudicada em relação às quebras na dupla fita do DNA devido à baixa expressão desta rede de genes e,
portanto, falham no reparo preciso e acumulam mais danos no DNA, aumentando a instabilidade do genoma. Estes pesquisadores sugerem que a instabilidade do genoma em pacientes com FL/PNS seria um mecanismo molecular bastante pertinente para explicar parcialmente a causa do desenvolvimento desta malformação congênita, como também serviria para associá-la a uma possível etiologia em comum com o desenvolvimento de câncer nos fissurados, conforme apontam relatos na literatura (Zhu et al, 2002; Taioli et al, 2010; Vieira et al, 2012; Lima et al, 2013).
Sendo assim, o presente trabalho apresenta evidências concordantes com os achados de Kobayashi e colaboradores, pois a formação de fragmentos de DNA gerando MN, cromossomos dicêntricos construindo pontes nucleoplasmáticas, e amplificação gênica causando brotamentos são medidas fenotípicas sensíveis da eficiência de reparo do DNA. Como também, estes eventos causadores de instabilidade genômica são considerados etapas iniciais do processo de carcinogênese (Bonassi et al, 2011; Fenech et al, 2011).
Com a maior probabilidade das crianças fissuradas apresentarem mecanismos disfuncionais envolvendo o reparo do DNA, como discutido acima, o acúmulo de danos pode ser agravado quando as suas células são expostas a fatores exógenos causadores de quebras na dupla fita do DNA, os quais podem superar a capacidade de um reparo já deficiente e afinal, contribuindo para aumentar a instabilidade do genoma (Kobayashi et al, 2013).
Nesta questão, cabe retomar a importância dos fatores ambientais em afetar as células de um embrião em desenvolvimento através da exposição materna (Pedersen et al, 2009). Além dos fatores exógenos discutidos inicialmente (tabagismo e alcoolismo), deve ser ressaltado que a deficiência do folato, a qual
pode ocorrer pela simples ingestão inadequada deste micronutriente, também representa um evento genotóxico, pois provoca alterações no padrão de metilação do DNA (Laanpere et al, 2010), causa hiperhomocisteinemia (Crott e Fenech, 2001; Picerno et al, 2007; Blanton et al, 2011), e provoca danos na estrutura do DNA, aumentando a frequência de MN, PN e BN (Beetstra et al, 2005; Lindberg et al, 2007; Fenech, 2012).
Além disso, em um estudo recente realizado por Bull et al (2012), linfócitos de apenas um indivíduo cultivados em diferentes concentrações de folato por 21 dias apresentaram anormalidades nucleares distintas dos biomarcadores clássicos do CBMN. Estas novas estruturas, denominadas de “núcleo fusionado”, “núcleo circular” e “núcleo em ferradura” indicam quebras de DNA que foram mal reparadas ou a fusão de telômeros disfuncionais (anormalmente curtos, por exemplo), gerando rearranjos cromossômicos complexos que falharam na segregação para os pólos celulares durante a mitose, provavelmente devido à hipometilação do DNA induzida pela deficiência prolongada de ácido fólico. Consequentemente, foi se instaurando uma elevação na instabilidade genômica, a qual encaminhava as células à apoptose até os últimos dias de cultivo. Posteriormente, outro experimento similar foi executado com células de mais indivíduos, confirmando o efeito da deficiência crônica de ácido fólico na formação de núcleos circulares, em ferradura e fusionados (Lee et al, 2014).
Os linfócitos de alguns dos pacientes fissurados que apresentaram estas anomalias nucleares, mesmo que em baixa frequência, reforçam as evidências de que estes pacientes apresentam uma inerente alta instabilidade genômica, já que foi possível a visualização dessas estruturas no modelo clássico (agudo) do ensaio do CBMN mesmo sem interferir nos níveis de folato do meio.
Além disso, estas observações também sugerem um possível estabelecimento de deficiência nutricional crônica na população estudada, a qual representa um fator modulador na manutenção da integridade do genoma, podendo ter afetado o desenvolvimento intrauterino das crianças (Fenech, 2010; Milne et al, 2015). Sobre este aspecto, em um estudo prévio com pacientes fissurados também residentes em Natal/ RN e igualmente atendidos no HOSPED, foi identificado que