O meio de cultura Tryptic Soy Broth (TSB) foi preparado para a reativação da Candida albicans utilizada neste estudo. Esse meio de cultura constitui-se de um caldo nutriente que propicia o crescimento de vários tipos de micro-organismos. A manipulação e a esterilização foram realizadas de acordo com as recomendações do fabricante. Para o preparo do meio, foi utilizada uma proporção de 30 g de pó do meio de cultura para 1 L de água destilada. O pó proporcionado foi colocado em um béquer, e a água foi adicionada. A seguir, o béquer foi aquecido em banho-maria para a dissolução completa do meio de cultura na água destilada. Após a dissolução, a solução resultante foi distribuída em tubos de ensaio. Uma alíquota de 5 mL do meio de cultura preparado foi pipetada e dispensada em cada um dos tubos de ensaio. Esses tubos foram devidamente identificados, datados, tampados com algodão e colocados em autoclave vertical para esterilização a 121oC por 15 minutos. Após esse procedimento, os tubos de ensaio tampados foram deixados ao ar livre até atingirem a temperatura ambiente. Finalmente, foram armazenados em geladeira a 5oC até a utilização nos procedimentos experimentais.
A solução salina utilizada nas diluições seriadas realizadas neste estudo foi preparada pela diluição completa de 8,5 g de cloreto de sódio em 1 L de água destilada. A dissolução do sal na água destilada foi realizada em um béquer, pela manipulação de uma haste de vidro. Após a
dissolução, a solução salina resultante, na concentração de 0,15 mol, foi distribuída em tubos de ensaio. Para a distribuição, pipetou-se 1000 μL de solução salina em tubos de ensaio, que foram utilizados para armazenamento dos swabs passados nas línguas dos animais após o experimento. A partir desses tubos, iniciaram-se as diluições seriadas. Para a realização dessas diluições, 900 μL de solução salina foram pipetados e transferidos para outros tubos de ensaio. A seguir, esses tubos foram tampados com algodão hidrófobo e levados em autoclave vertical para esterilização a 121oC por 15 minutos. Após a esterilização, os tubos de ensaio foram deixados ao ar livre até atingirem a temperatura ambiente. Finalmente, os tubos contendo solução salina foram armazenados em geladeira a 5oC até a utilização nos procedimentos experimentais.
O meio de cultura Sabouraud Dextrose Agar (SDA) contendo 5 μg/mL de cloranfenicol foi utilizado nas semeaduras das placas de Petri. Esse meio de cultura apresenta-se sólido após o preparo, sendo seletivo para a cultura de fungos. Para o preparo do meio de cultura, foi utilizada a proporção recomendada pelo fabricante: 65 g de pó misturada a 0,005 g de cloranfenicol para 1 L de água destilada. O meio de cultura proporcionado foi individualmente colocado em um béquer e misturado com a água destilada. A seguir, o béquer foi levado ao banho-maria até que ocorresse a dissolução completa do meio de cultura. Uma alíquota de 20 mililitros da solução resultante foi pipetada e dispensada em tubos de ensaio, ainda na fase líquida (temperatura superior à temperatura de solidificação). A seguir, os tubos de ensaio foram devidamente identificados, datados, tampados com algodão e levados em autoclave vertical para esterilização a 121oC por 15 minutos. Após a esterilização, os meios de cultura, ainda na fase líquida, foram vertidos em placas de Petri estéreis. Esse procedimento foi realizado com as placas bem próximas ao bico de Bunsen aceso para evitar contaminação das mesmas.
É importante ressaltar que as placas de Petri utilizadas foram compradas já esterilizadas e eram descartáveis, segundo recomendações do fabricante. Dessa maneira, não foi necessária a realização de procedimentos de esterilização para as mesmas. Os filtros utilizados para vedar as placas foram cortados em círculos de acordo com o formato e tamanho das placas de petri. Esses filtros foram embalados em papel alumínio e colocados em autoclave vertical para esterilização a 121oC por 15 minutos. Após a esterilização dos filtros, os mesmos foram colocados próximos à chama do bico de Bunsen. Os tubos de ensaio foram individualmente vertidos nas placas de Petri. Cada tubo de ensaio contendo 20 mL do meio foi aberto e o conteúdo do mesmo foi vertido na parte inferior da placa de Petri. Em seguida, os filtros foram colocados individualmente sobre a parte inferior das placas e as mesmas foram então fechadas, datadas e mantidas em temperatura ambiente para esfriar. A seguir, a parte inferior de cada placa de Petri foi externamente dividida em quadrantes. Esses quadrantes foram traçados com caneta para retroprojetor para facilitar posteriormente os procedimentos de semeadura dos micro-organismos (diluição seriada por quadrante). Finalmente, as placas de Petri foram armazenadas em geladeira a 5oC para serem utilizadas nos procedimentos de semeadura dos micro- organismos recuperados da cavidade oral dos animais.
A água de beber dos camundongos utilizados neste estudo foi preparada pela diluição completa de 1g de tetraciclina em 1L e 200 mL de água. Para a realização desse procedimento, uma balança digital de alta precisão foi ligada, um pratinho plástico específico para esse tipo de balança foi colocado sobre a mesma que foi então calibrada em zero. Em seguida, com o auxílio de uma espátula pesou-se 1g de tetraciclina. A quantidade de água necessária para a diluição da substância antibiótica foi medida em uma proveta de 2L. A tetraciclina foi diluída em água com o auxílio de uma haste de vidro. Após a total diluição, a solução final ficou a uma concentração de 0,83mg/mL de tetraciclina. A solução foi então
colocada em recipiente âmbar, o qual foi vedado com parafilm e papel alumínio e armazenada em refrigerador a 5º C até o momento de ser utilizada.