7 Brukerstøtte
7.2 Hvordan gjennomføres kurs?
Na busca por genes de ciclotídeos em plantas do continente americano, algumas espécies presentes no bioma Cerrado foram estudadas. A primeira a ser explorada foi Palicourea rigida (Figura 16), devido, principalmente, à especificidade dos primers, os quais foram desenhados baseando-se na sequência do ciclotídeo parigidina-br1, sendo a única evidencia protéica norteadora do trabalho.
Figura 16 - Fotos da planta Palicourea rigida, encontrada no Cerrado. Em evidência, suas folhas
grandes, largas e coriáceas, as quais foram utilizadas nos experimentos.
Disponível em: <http://www.parquesucupira.com/2013/03/planta-da-semana-bate-caixa- palicourea.html>. Acesso em: 15/06/2013.
As folhas de P. rigida foram utilizadas no processo de extração de RNA total através de dois tampões inclusos no InviTrap® Spin Plant RNA Mini Kit: (I) Lysis Solution DCT, indicado para espécies que contenham grandes quantidades de fenol em seu tecido foliar; e (II) Lysis Solution RP, indicado para espécies que contenham grandes quantidades de polissacarídeos em seu tecido foliar. Após extração, o RNA total foi quantificado através de metodologia fluorimétrica Qubit (Invitrogen) e sua integridade e qualidade foram aferidas por eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo (Figura 17).
Figura 17 - Eletroforese em gel de agarose 1% da extração de RNA total de P. rigida através dos
tampões Lysis Solution DCT e Lysis Solution RP. Nos poços foram aplicados: (1) Marcador 1 Kb Plus
DNA Ladder (Invitrogen), onde os números ao lado indicam o tamanho relativo das bandas em pares
de base; (2), (3) e (4) extração de RNA com tampão Lysis Solution DCT, contendo 60 ng, 120 ng e 180 ng de RNA, respectivamente; (5), (6) e (7) extração de RNA com tampão Lysis Solution RP, contendo 60 ng, 120 ng e 180 ng de RNA, respectivamente.
Utilizando a mesma quantidade de tecido foliar e as duas soluções em paralelo, foi possível avaliar a melhor metodologia para extração de RNA desta espécie. As duas soluções se mostraram eficientes, com semelhante perfil de extração, rendendo um RNA total de qualidade, sem contaminação com DNA e sem degradação aparente do RNA ribossomal (rRNA) (rRNA nuclear: 25/26S e 17/18S; rRNA de cloroplasto: 23S e 16S; e rRNA mitocondrial: 18S). Mesmo com bastante similaridade com relação à qualidade do RNA extraído utilizando as duas soluções, o tampão Lysis Solution DCT foi selecionado para todas as outras extrações necessárias durante o desenvolvimento da pesquisa, pois apresentou uma pequena superioridade quanto à quantidade de RNA extraído (330 ng/µL) quando comparado com o tampão Lysis Solution RP (300 ng/µL), sendo selecionado para utilização nos experimentos subsequentes.
A partir deste RNA foi sintetizada a primeira fita de DNA complementar (cDNA) através do SuperScript® II Reverse Transcriptase Kit (Invitrogen™), do qual foi utilizado 1 µL como molde em amplificações por PCR, contendo 0,5 µM de cada primer desenhado para busca em Rubiaceae (PrF1.1, PrF3.1, OaF1 e HcF1) (Tabela 1) e do Oligo-dT. As reações foram configuradas com 53 ºC de temperatura de anelamento. Todas as reações foram realizadas com o tempo de 1 min de extensão, levando em consideração que o maior precursor completo de ciclotídeos conhecido em Rubiaceae possui 210 aminoácidos (OaK2), o qual é produzido por O. affinis e é do tipo triplo, codificado por um mRNA de
1 2 3 4 5 6 7 1000 850 650 500 400 300 200 100
aproximadamente 630 pb (JENNINGS et al., 2001), na tentativa de amplificação de um fragmento do gene do ciclotídeo parigidina-br1 de tamanho desconhecido (Figura 18). Figura 18 - Eletroforese em gel de agarose 1% da amplificação por PCR de cDNA de P. rigida com
os primers desenhados para buscas em Rubiaceae, com 53 ºC de temperatura de anelamento e tempo de 1 min de extensão. Nos poços foram aplicados: (1) Marcador 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen), onde os números ao lado indicam o tamanho relativo das bandas em pares de base; (2) PCR contendo o conjunto de primers PrF1.1+Oligo-dT; (3) PCR contendo o conjunto de primers PrF3.1+Oligo-dT; (4) PCR contendo o conjunto de primers OaF1+Oligo-dT; (5) PCR contendo o conjunto de primers HcF1+Oligo-dT.
Nenhuma amplificação foi observada nas reações contendo as combinações de primers PrF1.1+Oligo-dT, OaF1+Oligo-dT e HcF1+Oligo-dT, apenas apresentando resultado positivo a reação decorrente da utilização do conjunto de primers PrF3.1+Oligo- dT, onde foi possível a visualização de uma banda de tamanho aparente entre 350-400 pb.
Devido apresentação de apenas uma banda no gel, realizou-se a purificação deste fragmento com o GeneJET™ PCR Purification Kit (Fermentas) e o sequenciamento com o equipamento 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems/Life Technologies™), utilizando o iniciador PrF3.1, o qual resultou em uma sequência contendo 254 nucleotídeos. A mesma foi traduzida in silico pelo programa BioEdit, revelando apenas um fragmento do gene de um precursor proteico de ciclotídeo, codificando apenas os últimos aminoácidos do peptídeo (CYYN), inserido no MCD, e a cauda hidrofóbica (GLNPEKI), contendo toda a região não traduzida da extremidade 3' do mRNA (3'-UTR) até a cauda poli A. Entretanto, diferente do esperado, o aminoácido C-terminal do ciclotídeo encontrado neste fragmento gênico não apresentou a mesma sequência para a mesma posição do ciclotídeo parigidina-br1 (CYYD), possivelmente indicando a descoberta de um gene diferente do alvo do projeto. Além disso, como foi realizado o sequenciamento direto, o resultado foi apenas a observação da região 3’-terminal deste gene, sendo necessária sua clonagem para abranger a sequência completa contida neste fragmento.
1 2 3 4 5 1000 650 500 400 300 200 850
Para obtenção da sequência completa do fragmento amplificado, o produto de PCR já purificado foi inserido no vetor pGEM®-T, incubando a reação de ligação a 4ºC overnight. Após a ligação, o plasmídeo foi utilizado para transformação de cepas E. coli XL1-Blue por eletroporação, conforme discriminado na metodologia. Depois de transformadas e plaqueadas, 25 colônias foram selecionadas. Para confirmação da presença dos insertos, as colônias selecionadas foram utilizadas como molde em PCR de colônia, revelando a presença de insertos de diferentes tamanhos entre as colônias (Figura 19).
Figura 19 - Eletroforese em gel de agarose 1% da amplificação dos insertos por PCR das colônias
selecionadas, utilizando o conjunto de primers SP6+T7. Nos poços do gel A foram aplicados: (1) Marcador O'GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (Thermo Scientific Fermentas); (2), (3), (4), (5), (6), (7) e (8) amplificação dos insertos das colônias 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, respectivamente. Nos poços do gel
B foram aplicados: (1) Marcador O'GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (Thermo Scientific
Fermentas); (2), (3), (4), (5), (6), (7) e (8) amplificação dos insertos das colônias 8, 9, 10, 11, 12, 13 e 14, respectivamente. Nos poços do gel C foram aplicados: (1) Marcador O'GeneRuler 100 bp Plus
DNA Ladder (Thermo Scientific Fermentas); (2), (3), (4), (5), (6), (7) e (8) amplificação dos insertos
das colônias 15, 16, 17, 18, 19, 20 e 21, respectivamente. Nos poços do gel D foram aplicados: (1) Marcador O'GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (Thermo Scientific Fermentas); (2), (3), (4) e (5) amplificação dos insertos das colônias 22, 23, 24 e 25, respectivamente. Os números ao lado do marcador indicam o tamanho relativo das bandas em pares de base.
1000 700 600 500 400 300 200 100 800 900 1 2 3 4 5 6 7 8
A
1000 700 600 500 400 300 200 100 800 900C
1 2 3 4 5 6 7 8D
1 2 3 4 5 1000 700 600 500 400 300 200 100 800900B
700 600 500 400 300 200 100 800900 1 2 3 4 5 6 7 8 1000Como era anteriormente conhecido o tamanho do produto de PCR (~350 pb), somado ao fragmento de vetor pGEM®-T e aos iniciadores SP6 e T7 (~170 pb), apenas os clones contendo insertos superiores a 400 pb (2, 5, 6, 7, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20 e 22) foram submetidos ao processo de extração de DNA plasmidial e sequenciados, totalizando 12 amostras. Cada plasmídeo foi sequenciado em triplicata para cada primer (SP6 e T7), resultando em 36 sequências para cada primer, totalizando 72 sequências. Destas, 55 sequências exibiram qualidade suficiente para serem analisadas.
O resultado do sequenciamento foi analisado através do programa DNA Baser Sequence Assembler, onde foi possível a remoção das regiões do vetor pGEM®-T e construção de uma sequência consenso para cada clone, as quais foram traduzidas in silico pelo programa BioEdit, revelando que, das 12 colônias selecionadas para o sequenciamento, 5 não possuíam sequências que codificavam precursores de ciclotídeos. As outras 7 colônias apresentaram sequências positivas para um gene parcial de precursor de ciclotídeo, exibindo a mesma sequência, contendo 227 nucleotídeos, codificando 25 aminoácidos do peptídeo (EACVFIPCITSIAGCSCKNKVCYYN), contendo cerca de 80% do MCD, e a mesma cauda hidrofóbica (GLNPEKI), além de grande parte da região não traduzida da extremidade 3' do mRNA (3'-UTR) (Figura 20).
Este resultado corrobora os dados obtidos anteriormente, a partir do sequenciamento direto, revelando a sequência parcial de um gene de ciclotídeo, codificando um precursor proteico denominado Pri1 (Palicourea rigida 1), contendo um peptídeo inserido no MCD diferente do ciclotídeo parigidina-br1, apresentando diferença em três resíduos de aminoácido (Figura 20).
Figura 20 - Alinhamento realizado pelo software ClustalW2 entre o ciclotídeo parigidina-br1 e o
ciclotídeo presente em Pri1. As setas pretas indicam as diferenças entre as duas sequências.
Diferentemente do esperado, mesmo com a sequência incompleta, Pri1 não codifica a mesma sequência peptídica do ciclotídeo parigidina-br1, isolado da planta P. rigida através de purificação por técnicas cromatográficas (PINTO et al., 2011a), sobre o qual foram desenhados os oligonucleotídeos iniciadores, apresentando diferença em três resíduos de aminoácidos: (1) a presença de uma alanina ao invés de uma serina, alteração
Parigidina-br1 GGSVPCGESCVFIPCITSLAGCSCKNKVCYYD--- 32
Pri1 ---EACVFIPCITSIAGCSCKNKVCYYNGLNPEKI 32
*:*********:************:
bastante significativa tanto a nível de códon (Ser: UC_ / AGU / AGC ; Ala: GC_ ) quanto a nível bioquímico (Ser: aminoácido polar não carregado; Ala: aminoácido apolar); (2) substituição de uma leucina por uma isoleucina, os quais apresentam códons bastante semelhantes, com diferença apenas na primeira base da trinca (Leu: UUG / UUA / CU_; Ile: AUU / AUC / AUA), e não significativa bioquimicamente devido grande semelhança entre os dois, que pertencem a mesma classe de aminoácidos apolares; (3) e uma troca significativa de uma asparagina por um aspartato, que, embora sejam similares a nível de códon (Asn: AAU / AAC; Asp: GAU / GAC), codificam aminoácidos de classes bioquímicas distintas (Asn: polar não carregado; Asp: polar carregado negativamente).
Assim, levando em consideração essas variações, possivelmente a sequência encontrada trata-se do isolamento de um gene contendo uma variante do ciclotídeo parigidina-br1, ou então, a possível descoberta de um gene codificante de um novo ciclotídeo em P. rigida, denominado parigidina-br2.
Da mesma forma que a parigidina-br1, o ciclotídeo traduzido in silico não apresenta uma prolina no loop 5, sendo também classificado na família das Braceletes. Além do conhecimento da sequência parcial do MCD, também foi possível desvendar a região C- terminal (CTR) de Pri1, codificando os aminoácidos GLNPEKI, a qual é bastante comum entre os outros precursores de Rubiaceae, como a cauda hidrofóbica do precursor do ciclotídeo chassatídeo C4 (GLNPESI), encontrado em C. chartaceae (NGUYEN et al., 2012), que possui a mesma quantidade de aminoácidos e 85% de similaridade de sequência. Outros precursores de Rubiaceae também possuem a mesma quantidade de resíduos de aminoácidos no CTR, como os precursores OaK1 (GLPSLAA), OaK3 (GLPDVAA) e OaK10 (GLPSLAA), todos encontrados em O. affinis (JENNINGS et al., 2001; MYLNE et al., 2010).
Para a obtenção da sequência completa do gene do precursor de ciclotídeo encontrado (Pri1), o RNA total de P. rigida foi submetido à síntese de cDNA dupla-fita através do ExactSTART™ Eukaryotic mRNA 5'- & 3'-RACE Kit (Epicentre). Para ser utilizado na amplificação da extremidade 5' deste cDNA, inicialmente, um oligonucleotídeo iniciador no sentido antisenso foi desenhado dentro da região 3'-UTR da sequência (Pr5R), logo após o códon terminador (Figura 21).
Figura 21 - Sequência parcial de nucleotídeos do gene Pri1. As letras em vermelho representam o
códon terminador, e a região destacada em azul representa o local de anelamento do oligonucleotídeo iniciador no sentido antisenso (Pr5R).
Em amplificações por PCR foram utilizados 1 µL, 2 µL e 3 µL de cDNA como molde, contendo 0,5 µM dos primers (Primer1+Pr5R). As reações foram configuradas com 50 ºC, 55 ºC e 60 ºC de temperatura de anelamento, para que fosse possível encontrar a melhor condição de amplificação. Todas as reações foram feitas com 1 min de extensão, já que se trata de um gene com região 5'-UTR de tamanho desconhecido. Em todas as variações de condições de quantidade de cDNA molde e de temperatura de anelamento foram observadas amplificações de um fragmento com exatamente o mesmo tamanho, de aproximadamente 400 pb (Figura 22).
Figura 22 - Eletroforese em gel de agarose 1% da amplificação por PCR da extremidade 5' do cDNA
de P. rigida. Nos poços foram aplicados: (1) Marcador 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen), onde os números ao lado indicam o tamanho relativo das bandas em pares de base; (3), (4) e (5) PCR contendo 1 µL, 2 µL e 3 µL de cDNA, respectivamente, com 50 ºC de temperatura de anelamento ; (7), (8) e (9) PCR contendo 1 µL, 2 µL e 3 µL de cDNA, respectivamente, com 55 ºC de temperatura de anelamento; (11), (12) e (13) PCR contendo 1 µL, 2 µL e 3 µL de cDNA, respectivamente, com 60 ºC de temperatura de anelamento; (15) PCR sem DNA molde, como controle negativo.
Devido apresentação de apenas uma banda no gel, esta reação de PCR foi purificada com o GeneJET™ PCR Purification Kit (Fermentas) e o fragmento foi inserido no
GAGGCTTGTGTTTTTATCCCGTGCATCACTTCTATTGCTGGTTGCAGTTGCAAAAACAAA 60 GTCTGTTATTATAATGGTCTAAATCCTGAGAAAATTTAATGTGGTAGTGAACGGTTTGCC 120 <<<<<<<<<<<<<<<<<<<< TTTCTGATGACTGTTATCAAATCTATGTGTCAACAATAATTATAATTACAATTGTTTTCC 180 AGACAGTATCAGGATTTACAGTTGTAATGTGCGTTTAAATAATTCCC 227 1000 850 650 500 400 300 200 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 14 15
vetor pGEM®-T, incubando a reação de ligação a 4ºC overnight. Após a ligação, o plasmídeo foi utilizado para transformação de cepas E. coli XL1-Blue por eletroporação, conforme discriminado na metodologia. Depois de transformadas e plaqueadas, 11 colônias foram selecionadas. Para confirmação da presença dos insertos, as colônias selecionadas foram utilizadas como molde em PCR de colônia, revelando a presença de insertos de diferentes tamanhos entre as colônias (Figura 23).
Figura 23 - Eletroforese em gel de agarose 1% da amplificação dos insertos por PCR das colônias
selecionadas, utilizando o conjunto de primers SP6+T7. Nos poços foram aplicados: (1) Marcador 1
Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen), onde os números ao lado indicam o tamanho relativo das bandas
em pares de base; (2) PCR sem DNA molde, como controle negativo; (3) ao (13) amplificação dos insertos das colônias selecionadas.
Como era anteriormente conhecido o tamanho do produto de PCR (~400 pb), somado ao fragmento de vetor pGEM®-T e aos iniciadores SP6 e T7 (~170 pb), apenas os clones contendo insertos superiores a 400 pb foram submetidos ao processo de extração de DNA plasmidial e sequenciados, totalizando 9 amostras. Cada plasmídeo foi sequenciado em triplicata para cada primer (SP6 e T7), resultando em 24 sequências para cada primer, totalizando 48 sequências. Destas, 38 sequências exibiram qualidade suficiente para serem analisadas.
O resultado do sequenciamento foi analisado através do programa DNA Baser Sequence Assembler, onde foi possível a remoção das regiões do vetor pGEM®-T e construção de uma sequência consenso para cada clone, as quais foram traduzidas in silico pelo programa BioEdit, revelando que, das 9 colônias selecionadas para o sequenciamento, apenas 1 não possuía sequência codificadora de um precursor de ciclotídeo. As outras 8 colônias apresentaram sequências positivas para o gene Pri1, exibindo a mesma sequência. 1000 850 650 500 400 300 200 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13
A sequência completa do mRNA de Pri1 possui uma fase de leitura (ORF) de 249 nucleotídeos, a qual revelou a organização completa do primeiro precursor de ciclotídeo do continente Americano, codificando uma proteína multidomínio de 82 aminoácidos. Este novo precursor proteico apresenta a mesma configuração geral de um típico precursor de ciclotídeo, possuindo um peptídeo sinal para o reticulo endoplasmático (ER-Signal) com 20 aminoácidos, um pró-domínio N-terminal (NTPD) com 10 aminoácidos, um domínio de repetição do N-terminal (NTR) com 13 aminoácidos, um domínio do ciclotídeo maduro (MCD) com 32 aminoácidos (contendo a sequência do ciclotídeo parigidina-br2) e um domínio C-terminal (CTR) com 7 aminoácidos (Figura 24).
Figura 24 - Sequência completa do gene Palicourea rigida 1 (Pri1), contendo uma ORF de 249
nucleotídeos, a qual codifica in silico o precursor proteico do ciclotídeo parigidina-br2, contendo os domínios ER-Signal, NTPD, NTR, MCD e CTR. As letras em vermelho indicam o códon iniciador (ATG) e o terminador (TAA) da tradução do mRNA.
Este novo precursor elucidado é do tipo simples, ou seja, contém apenas um domínio de ciclotídeo, o que geralmente é encontrado nas espécies da família Rubiaceae, assim como os precursores OaK1, OaK3, OaK5, OaK7, OaK8, OaK9 e OaK10, isolados de O. affinis; Hbc1 e Hbc2, isolados de H. biflora; Hcf1, isolado de H. centranthoides; e ChaC2, ChaC4, ChaC7, ChaC8, ChaC13-18, isolados de C. chartacea (JENNINGS et al., 2001; MULVENNA et al., 2006; MYLNE et al., 2010; QIN et al., 2011; NGUYEN et al., 2011b; NGUYEN et al., 2012).
Porém, diferentemente dos precursores existentes em O. affinis, Pri1 apresenta o domínio NTPD extremamente reduzido, semelhante a alguns precursores encontrados em Rubiaceae, como ocorre em H. biflora e C. chartacea (NGUYEN et al., 2011b; NGUYEN et al., 2012). No caso específico de C. chartacea, todos os precursores encontrados nesta espécie, além do pequeno NTPD, também apresentam grande redução dos demais domínios, produzindo os menores precursores proteicos de ciclotídeos conhecidos até então, contendo apenas 70 aminoácidos, aproximadamente (NGUYEN et al., 2012), os
ATGGCCAAGTTTGCTAATCACCTTTTCCTCTTTTTCCTCATTGCCTCGTTTGTGATGTTGGAAGTT CACTCTTATGACGGGATGCAAGATTTGGGAAAAAGGCTGCTCATGAATGTTGACTCTCTCGGTGGT GGCAGTGTTCCTTGTGGTGAATCGTGCGTTTTTATCCCGTGCTTGACTTCTCTTGCTGGTTGCAGT TGCAAAAACAAAGTCTGTTATTATAATGGTCTAAATCCTGAGAAAATTTAA ER-Signal NTPD MCD CTR Sequência de Nucleotídeos Sequência de Aminoácidos MAKFANHLFLFFLIASFVMLEVHSYDGMQDLGKRLLMNVDSLGGGSVPCGESCVFIPCLTSLAGCSCKNKVCYYNGLNPEKI NTR
quais apresentam a maior similaridade com a sequência de Pri1, exibindo em torno de 65% de identidade (Figura 25).
Figura 25 - Alinhamento realizado pelo software ClustalW2 entre precursores de ciclotídeo isolados
de Rubiaceae, comparando as sequências e os tamanhos dos domínios, onde o comprimento em aminoácidos dos precursores estão indicados ao final de cada linha. Pri1: P. rigida; ChaC2, ChaC4 e ChaC8: C. chartacea; OaK1 e OaK2: O. affinis; Hbc1: H. biflora; Hcf1: H. centranthoides.
Através da tradução in silico do precursor Pri1 foi possível analisar a sequência completa do ciclotídeo presente em seu MCD, onde foram observadas poucas distinções quando comparado à parigidina-br1. A nova sequência, da mesma forma que a parigidina- br1 e a sequência parcial encontrada anteriormente, o ciclotídeo traduzido in silico não apresenta uma prolina no loop 5, confirmando a classificação da parigidina-br2 na família das Braceletes. Analisando a sequência da parigidina-br2, não foi observada a substituição de uma alanina por uma serina, como identificado anteriormente, onde apenas duas modificações em resíduos de aminoácidos foram observadas quando comparada à parigidina-br1: (1) novamente, a substituição de uma leucina por uma isoleucina, porém, em outra posição; (2) e a mesma substituição significativa de uma asparagina por um aspartato. (Figura 26).
Figura 26 - Alinhamento realizado pelo software ClustalW2 entre o ciclotídeo isolado de P. rigida,
parigidina-br1, e a sequência completa do MCD traduzida in silico, parigidina-br2. As variações existentes entre as sequências estão indicadas pelas setas pretas.
Parigidina-br1 GGSVPCGESCVFIPCITSLAGCSCKNKVCYYD 32
Parigidina-br2 GGSVPCGESCVFIPCLTSLAGCSCKNKVCYYN 32
***************:***************:
ChaC8 MAKFANYLMLFLLVASLV---MLEAQSSDTIKA---
ChaC2 MAKFANYLMLFLLVASLV---MLEAQSSDTIKV---
ChaC4 MAKFAT--QLFLLTASVV---MLEVQSSIVIMQD---
Pri1 MAKFANHLFLFFLIASFV---MLEVHSYDGMQ---
Hcf1 MASFINYLIMFLLGAAFLGVLEVECAEADQTVVD---IRKILDPPT---EID----
Hbc1 MAHFIKYLIMFLVIAACVGVLEVESAEADLTALG---VRKMLDPPT---EVS----
OaK3 MAKFTNCLALCLLLAAVVGAFGVELSEADKSAVVNEIAEKMALQEMLDGVD---KLFLRKMK----
OaK1 MAKFTVCLLLCLLLAAFVGAFGSELSDSHKTTLVNEIAEKMLQRKILDGVEATLVTDVAEKMFLRKMKAEAK
** * : :: *: : * .
ChaC8 PDWGKRLLMNHDSDL----GAIPCGESCVWIPC-ISTVIGCSCSN-KVCYR---- 75 ChaC2 PDLGKRLLMNRDPN-----GIP-CAESCVWIPCTITALMGCSCKN-NVCYNNEL--- 77
ChaC4 PDLGRKLIMNPAN----GA-SCGETCFTGIC---FTAGCSCNPWPTCTRNGLNPESI--- 78
Pri1 -DLGKRLLMNVDSLG---GGSVPCGESCVFIPC-LTSLAGCSCKN-KVCYYNGLNPEKI--- 82
Hcf1 ISLAAEIQFKKELMGRLK-GIP-CGESCHYIPC-VTSAIGCSCRN-RSCMRNELTP--AATYETD 105
Hbc1 ISLATEIQFKKELLGRLK-GTR-CGETCFVLPC-WSAKFGCYCQK-GFCYRNELTPTAAAASESE 107
OaK3 SSETTLTMFLKEMQ--LK-GLPVCGETCTLGTC-YTQ--GCTCSW-PICKRNGLPDVAA--- 111 OaK1 TSETADQVFLKQLQ--LK-GLPVCGETCVGGTC-NTP--GCTCSW-PVCTRNGLPSLAA--- 124 . : * *.*:* * ** * *
ER-Signal NTPD
A principal diferença encontrada entre a sequência parcial e completa do ciclotídeo parigidina-br2 situa-se dentro da região de anelamento do primer PrF3.1 (substituição da serina por uma alanina), o qual possui 4 degenerações: duas delas sendo a presença de inosina, capaz de parear indiscriminadamente com adenina, timina ou citosina; e duas delas sendo a presença de Y, representando uma base pirimídica, capaz de parear com citosina ou timina). Essas degenerações geram diferentes possibilidades de combinações e pareamentos diversos, o que pode refletir em um erro de cópia durante a PCR e resultar diferenças pontuais na sequência final. Além disso, erros pontuais durante o sequenciamento de DNA podem gerar alterações nos códons, refletindo em pequenas modificações na sequência de aminoácidos, como é o caso das substituições de leucina por isoleucina, as quais apresentam códons bastante parecidos. Dessa forma, as diferenças existentes entre as duas não foram consideradas significantes, considerando-se então se tratar do mesmo gene, Pri1.
Já as duas diferenças encontradas entre a parigidina-br1 e a parigidina-br2 podem ser explicadas por duas hipóteses: (1) como a massa monoisotrópica dos resíduos de aminoácidos Leu e Ile são a mesma (113,084 Da), durante o processo de sequenciamento do ciclotídeo parigidina-br1 por LC-MS/MS pode ter ocorrido um equívoco em sua identificação, gerando essa diferença entre as sequências; (2) porém, a diferença entre as massas monoisotrópicas dos aminoácidos Asn (114,014 Da) e Asp (115,089 Da) é suficiente para sua distinção e correta identificação, sugerindo então que o ciclotídeo predito em Pri1 seja classificado corretamente como parigidina-br2, representando uma variação de parigidina-br1. A diferença entre o resíduo D ou N ao final da sequência é a mesma entre a kalata B1 e a kalata B4, as quais são produzidas por O. affinis. A diferença de apenas um aminoácido entre dois ciclotídeos é suficiente para sua classificação e nomeação diferencial, como ocorre com a kalata B1 quando comparada à outros ciclotídeos, como a kalata S, cicloviolacina B6, cicloviolacina B7 e cicloviolacina O22 (Figura 27).
Figura 27 - Alinhamento realizado pelo software ClustalW2 entre ciclotídeos das famílias Rubiaceae
e Violaceae, contendo apenas um resíduo de aminoácido de diferença. Os resíduos destacados em vermelho evidenciam as diferenças existentes nas sequências em relação à kalata B1.