Continuando a busca por novos precursores gênicos de ciclotídeos em plantas
presentes no bioma Cerrado, após investigação da família Rubiaceae, a qual foi a primeira
a ter ciclotídeos e seus genes elucidados, e da família Violaceae, que representa o grupo
vegetal detentor da maior diversidade e abundancia de sequências de ciclotídeos e seus
genes produtores depositadas em bancos de dados, uma espécie do gênero Clitoria foi
escolhida como representante da família Fabaceae, o qual foi o terceiro grupo vegetal com
genes de ciclotídeos elucidados e detentora de numerosas espécies importantes para o
agronegócio mundial.
O gênero Clitoria foi selecionado devido à proximidade taxonômica com a espécie
Clitoria ternatea, única representante da família Fabaceae a ser investigada pela produção
de ciclotídeos, possuindo 12 precursores proteicos elucidados, os quais apresentam uma
organização gênica única, alocando no mesmo precursor um domínio de ciclotídeo (MCD) e
um domínio da cadeia A da albumina de ervilha (Pisum sativum Albumin 1-A chain),
nomeados de quiméricos. Esta característica aumentou a curiosidade sobre as espécies da
família Fabaceae presentes no bioma Cerrado, justificando a busca por ciclotídeos em
Clitoria sp. (Figura 47).
Figura 47 - Fotos da planta Clitoria sp., encontrada no Cerrado. Em evidência, suas folhas
pequenas, finas e pilosas, as quais foram utilizadas nos experimentos.
Como não havia nenhuma evidência de ciclotídeos na família Fabaceae no
continente Americano, todo o trabalho desenvolvido com Clitoria sp. foi norteado por 10
sequências completas de mRNA de genes produtores de precursores de ciclotídeos
isoladas de C. ternatea. Essas 10 sequências de genes completos foram utilizadas em
múltiplos alinhamentos, realizados pelo software ClustalW2, na busca por regiões
conservadas, onde foram desenhados 5 primers (apenas 1 sem degenerações). A mesma
metodologia aplicada na família Violaceae foi utilizada em Clitoria sp., buscando regiões
conservadas no início dos genes com a intenção de isolar novos precursores
semicompletos, sem evidências proteicas.
Assim, as folhas de Clitoria sp. foram utilizadas no processo de extração de RNA
total através do uso de TRIzol® Reagent (Ambion), seguindo as especificações do
fabricante. Após a extração, o RNA total foi quantificado através de metodologia
fluorimétrica Qubit (Invitrogen) e sua integridade e qualidade foram aferidas por eletroforese
em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo (Figura 48).
Figura 48 - Eletroforese em gel de agarose 1% da extração de RNA total de Clitoria sp. através do
uso de TRIzol® Reagent (Ambion). Nos poços foram aplicados: (1) Marcador 1 Kb Plus DNA Ladder
(Invitrogen), onde os números ao lado indicam o tamanho relativo das bandas em pares de base; (3)
extração de RNA de Clitoria sp., contendo 300 ng.
Após a visualização em gel de agarose, foi possível perceber que o processo de
extração mostrou-se eficiente, rendendo um RNA total de qualidade, apresentando bandas
íntegras, sem degradação aparente do RNA ribossomal (rRNA) (rRNA nuclear: 25/26S e
17/18S; rRNA de cloroplasto: 23S e 16S; e rRNA mitocondrial: 18S).
A partir deste RNA fita simples foi sintetizada a primeira fita de cDNA através do
SuperScript® II Reverse Transcriptase Kit (Invitrogen™), do qual foi utilizado 1 µL como
molde em amplificações por PCR, contendo 0,5 µM de cada iniciador desenhado para
busca em Fabacea (CtF1-5) e do Oligo-dT. Devido à quantidade de primers para serem
testados, o volume de cDNA seria insuficiente para testes com várias temperaturas de
anelamento para cada primer. Assim, todas as reações foram configuradas com 55 ºC de
temperatura de anelamento e realizadas com tempo de 1 min de extensão, devido à pouca
informação existente sobre genes de ciclotídeos na família Fabaceae, na tentativa de
amplificação de algum gene semicompleto de tamanho desconhecido.
Nenhuma amplificação foi observada na reação contendo o primer CtF1, único
primer desenhado sem degenerações em sua sequência. Os primers CtF2, CtF4 e CtF5
geraram amplificações preferenciais de um fragmento abaixo de 300 pb, tamanho
considerado insuficiente para conter um gene semicompleto codificador de um precursor de
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ciclotídeo. Apenas o primer CtF3 apresentou resultado positivo, onde foi possível a
visualização de uma banda de aproximadamente 600 pb (Figura 49).
Figura 49 - Eletroforese em gel de agarose 1% da amplificação por PCR de cDNA de Clitoria sp.
utilizando primers de Fabaceae, com 55 ºC de temperatura de anelamento e 1 min de extensão. Nos
poços foram aplicados: (1) Marcador 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen), onde os números ao lado
indicam o tamanho relativo das bandas em pares de base; (2) PCR sem DNA molde, como controle
negativo; (3) PCR com conjunto de primers CtF1+Oligo-dT; (4) PCR com conjunto de primers
CtF2+Oligo-dT; (5) PCR com conjunto de primers CtF3+Oligo-dT; (6) PCR com conjunto de primers
CtF4+Oligo-dT; e (7) PCR com conjunto de primers CtF5+Oligo-dT.
Devido apresentação de apenas uma banda no gel e de tamanho aparente de 600
pb, apenas a reação contendo os iniciadores CtF3 e Oligo-dT foi purificada com o
GeneJET™ PCR Purification Kit (Fermentas) e o fragmento foi inserido no vetor pGEM®-T,
incubando a reação de ligação à 4ºC overnight. Após a ligação, o plasmídeo foi utilizado
para transformação de cepas E. coli XL1-Blue por eletroporação, conforme discriminado na
metodologia. Depois de transformadas e plaqueadas, 28 colônias foram selecionadas. Para
confirmação da presença dos insertos, as colônias selecionadas foram utilizadas como
molde em PCR de colônia, revelando a presença de insertos de diferentes tamanhos entre
as colônias (Figura 50).
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Figura 50 - Eletroforese em gel de agarose 1% da amplificação dos insertos por PCR das colônias
selecionadas, utilizando o conjunto de primers SP6+T7. Nos poços do gel A foram aplicados: (1)
Marcador 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); (2) ao (15) amplificação dos insertos das colônias 1 a
14. Nos poços do gel B foram aplicados: (1) Marcador 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); (2) ao (15)
amplificação dos insertos das colônias 15 a 28. Os números ao lado do marcador indicam o tamanho
relativo das bandas em pares de base.
Como era anteriormente conhecido o tamanho do produto de PCR (~600 pb),
somado ao fragmento de vetor pGEM®-T e aos iniciadores SP6 e T7 (~170 pb), apenas os
clones contendo insertos superiores a 600 pb foram submetidos ao processo de extração de
DNA plasmidial e sequenciados, totalizando 10 amostras. Cada plasmídeo foi sequenciado
em duplicata para cada primer (SP6 e T7), resultando em 20 sequências para cada primer,
totalizando 40 sequências. Destas, 33 sequências exibiram qualidade suficiente para serem
analisadas. O resultado do sequenciamento foi analisado através do programa DNA Baser
Sequence Assembler, onde foi possível a remoção das regiões do vetor pGEM®-T e
construção de uma sequência consenso para cada clone, as quais foram traduzidas in silico
pelo programa BioEdit. Após as análises, nenhuma das colônias selecionadas continha um
fragmento de DNA capaz de codificar um precursor proteico de ciclotídeos.
Este resultado negativo pode ser explicado devido à pouca quantidade de
informação gênica existente desta família, onde apenas 10 sequências de apenas uma
espécie de Fabaceae foram utilizadas para desenho dos primers, diferente da família
Violaceae, a qual possui mais de 100 genes de ciclotídeos elucidados, agregando mais
informações de diversidade de sequência e ampliando as ferramentas moleculares na
busca por novos genes, facilitando o desenho de primers. Dessa forma, mais estudos na
família Fabaceae precisam ser desenvolvidos, tanto na parte de bioquímica de proteínas
quanto na parte de biologia molecular de ciclotídeos, para que a busca por novas
sequências proteicas e gênicas de precursores sejam possibilitadas, proporcionando o
avanço nos conhecimentos dessa classe de moléculas de alto potencial biotecnológico.
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A
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6
CONCLUSÕES
Utilizando mRNA nos experimentos de 3'- e 5'-RACE e clonagem foram isolados
dois novos genes produtores de precursores proteicos de ciclotídeos de plantas do
Cerrado, pertencentes às famílias Rubiaceae e Violaceae;
Na espécie Palicourea rigida (Rubiaceae), o gene encontrado foi nomeado Pri1, o
qual possui uma ORF com 249 nucleotídeos. Traduzido in silico, este gene codifica
uma proteína precursora de 82 aminoácidos, contendo um novo ciclotideo,
denominado parigidina-br2, sendo este o primeiro gene de ciclotídeo descrito no
continente Americano. A partir de amplificações do DNA genômico de P. rigida foram
encontradas, pelo menos, duas cópias do gene Pri1: uma contendo um intron, com
131 nucleotídeos, o que é observado em todos os genes isolados da família
Rubiaceae, e outra sem intron, representando a primeira reportagem de um gene de
ciclotídeo sem intron na família Rubiaceae;
Através dos experimentos de Southern Blot, foi possível observar a imunodetecção
de diferentes regiões do DNA contendo a mesma sequência do gene Pri1,
comprovando a característica multigênica dos ciclotídeos;
Na espécie Hybanthus lanatus (Violaceae), o primeiro gene de ciclotídeo foi descrito,
nomeado Hyla1. Sua sequência possui uma ORF com 330 nucleotídeos e codifica
uma proteína precursora de 109 aminoácidos. Este precurosr possui um novo
ciclotideo, denominado hyla-br1, o qual também representa a descrição da primeira
sequência de ciclotideo pertencente à familia Violaceae no continente Americano;
A eficácia da metodologia de utilização de regiões conservadas no início dos gene
de ciclotideos da família Violaceae como alvo para o desenho de oligonucleotídeos
iniciadores foi comprovada, sendo descrito um gene sem nehuma evidência proteica
de ciclotídeos isolados desta família no continente Americano;
O mesmo resultado não foi observado na espécie Clitoria sp. (Fabaceae), onde a
mesma metodologia de desenho de iniciadores utilizada para a família Violaceae foi
aplicada, não sendo possível detectar nenhum gene codificador de precursor
proteico de ciclotídeo.
7
PERSPECTIVAS
Repetição dos experimentos de Southern Blot na espécie P. rigida para contagem
precisa do número de cópias do gene Pri1 presentes no genoma;
Utilização do DNA genômico de H. lanatus em amplificações por PCR para
confirmação da ausência de introns em genes de ciclotídeos desta família;
Realização de experimentos de Southern Blot na espécie H. lanatus para contagem
do número de cópias do gene Hyla1 presentes no genoma;
Realização de estudos sobre a expressão e biossíntese desses genes encontrados,
para compreensão do seu sistema de processamento;
Utilização das sequências gênicas descritas no desenvolvimento de sistemas
heterólogos de expressão para produção de ciclotídeos em larga escala,
possibilitando estudos de atividade biológica e de Ressonância Nuclear Magnética
(NMR), para compreensão das relações estrutura-função e mecanismos de ação.
REFERÊNCIAS
ABOYE, T. L. et al. Ultra-stable peptide scaffolds for protein engineering-synthesis and
folding of the circular cystine knotted cyclotide cycloviolacin O2. Chembiochem, v. 9, n. 1,
p. 103-113, 2008.
BARRY, D. G. et al. Linearization of a naturally occurring circular protein maintains
structure but eliminates hemolytic activity. Biochemistry, v. 42, n. 22, p. 6688-6695, 2003.
BASSE, C. W. Dissecting defense-related and developmental transcriptional responses of
maize during Ustilago maydis infection and subsequent tumor formation. Plant Physiol, v.
138, n. 3, p. 1774-1784, 2005.
BOKESCH, H. R. et al. A novel anti-HIV macrocyclic peptide from Palicourea condensata.
J Nat Prod, v. 64, n. 2, p. 249-250, 2001.
BROWN, J. W. et al. Splicing signals and factors in plant intron removal. Biochem Soc
Trans, v. 30, n. 2, p. 146-149, 2002.
BURMAN, R. et al. Evaluation of toxicity and antitumor activity of cycloviolacin O2 in
mice. Biopolymers, v. 94, n. 5, p. 626-634, 2010.
CAMARERO, J. A. et al. Biosynthesis of a fully functional cyclotide inside living bacterial
cells. Chembiochem, v. 8, n. 12, p. 1363-1366, 2007.
CASCALES, L. et al. Identification and characterization of a new family of cell-penetrating
peptides: cyclic cell-penetrating peptides. J Biol Chem, v. 286, n. 42, p. 36932-36943, 2011.
CHEN, B. et al. Isolation and characterization of novel cyclotides from Viola hederaceae:
solution structure and anti-HIV activity of vhl-1, a leaf-specific expressed cyclotide. J Biol
Chem, v. 280, n. 23, p. 22395-22405, 2005.
CLAESON, P. et al. Fractionation Protocol for the Isolation of Polypeptides from Plant
Biomass. J Nat Prod, v. 61, n. 1, p. 77-81, 1998.
COLGRAVE, M. L. et al. The anthelmintic activity of the cyclotides: natural variants with
enhanced activity. Chembiochem, v. 9, n. 12, p. 1939-1945, 2008.
COLGRAVE, M. L.; CRAIK, D. J. Thermal, chemical, and enzymatic stability of the
cyclotide kalata B1: the importance of the cyclic cystine knot. Biochemistry, v. 43, n. 20, p.
5965-5975, 2004.
COWPER, B.; CRAIK, D. J.; MACMILLAN, D. Making ends meet: chemically mediated
circularization of recombinant proteins. Chembiochem, v. 14, n. 7, p. 809-812, 2013.
CRAIK, D. J. Chemistry: Seamless proteins tie up their loose ends. Science, v. 311, n. 5767,
p. 1563-1564, 2006.
CRAIK, D. J. Circling the enemy: cyclic proteins in plant defence. Trends Plant Sci, v. 14,
n. 6, p. 328-335, 2009.
CRAIK, D. J. Discovery and applications of the plant cyclotides. Toxicon, v. 56, n. 7, p.
1092-1102, 2010.
CRAIK, D. J. et al. Discovery, structure and biological activities of the cyclotides. Curr
Protein Pept Sci, v. 5, n. 5, p. 297-315, 2004.
CRAIK, D. J. et al. Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that
defines the cyclic cystine knot structural motif. J Mol Biol, v. 294, n. 5, p. 1327-1336, 1999.
CRAIK, D. J. Host-defense activities of cyclotides. Toxins, v. 4, n. 2, p. 139-156, 2012.
CRAIK, D. J. The folding of disulfide-rich proteins. Antioxid Redox Signal, v. 14, n. 1, p.
61-64, 2011.
CRAIK, D. J.; CEMAZAR, M.; DALY, N. L. The chemistry and biology of cyclotides. Curr
Opin Drug Discov Devel, v. 10, n. 2, p. 176-184, 2007.
CRAIK, D. J.; DALY, N. L. NMR as a tool for elucidating the structures of circular and
knotted proteins. Mol Biosyst, v. 3, n. 4, p. 257-265, 2007.
CRAIK, D. J.; MYLNE, J. S.; DALY, N. L. Cyclotides: macrocyclic peptides with
applications in drug design and agriculture. Cell Mol Life Sci, v. 67, n. 1, p. 9-16, 2010.
D'ALOISIO, E. et al. The Protein Disulfide Isomerase gene family in bread wheat (T.
aestivum L.). BMC Plant Biol, v. 10, n. 101, p. 1-29, 2010.
DALY, N. L. et al. Kalata B8, a novel antiviral circular protein, exhibits conformational
flexibility in the cystine knot motif. Biochem J, v. 393, n. 3, p. 619-626, 2006.
DALY, N. L.; GUSTAFSON, K. R.; CRAIK, D. J. The role of the cyclic peptide backbone in
the anti-HIV activity of the cyclotide kalata B1. FEBS Letters, v. 574, n. 1-3, p. 69-72, 2004.
DALY, N. L.; ROSENGREN, K. J.; CRAIK, D. J. Discovery, structure and biological
activities of cyclotides. Adv Drug Deliv Rev, v. 61, n. 11, p. 918-930, 2009.
DÖRNENBURG, H. Cyclotide synthesis and supply: from plant to bioprocess. Biopolymers,
v. 94, n. 5, p. 602-610, 2010.
DOWER, W. J. et al. Protocols for the Transformation of Bacteria by Electroporation. In:
CHANG, D. C. et al. Guide to electroporation and electrofusion. San Diego: Academic
Press, 1992. Cap. 30, p. 485-499.
DOYLE, J. J.; DOYLE, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh
leaf tissue. Phytochemical Bulletin, v. 19, p. 11-15, 1987.
DUTTON, J. L. et al. Conserved structural and sequence elements implicated in the
processing of gene-encoded circular proteins. J Biol Chem, v. 279, n. 45, p. 46858-46867,
2004.
GILLON, A. D. et al. Biosynthesis of circular proteins in plants. Plant J, v. 53, n. 3, p. 505-
515, 2008.
GÖRANSSON, U. et al. Seven novel macrocyclic polypeptides from Viola arvensis. J Nat
Prod, v. 62, n. 2, p. 283-286, 1999.
GRAN, L. An oxytocic principle found in Oldenlandia affinis DC. Medd Nor Farm Selsk,
v. 12, p. 173-180, 1970.
GRAN, L. et al. Oldenlandia affinis (R&S) DC: A plant containing uteroactive peptides used
in African traditional medicine. J Ethnopharmacol, v. 70, n. 3, p. 197-203, 2000.
GRAN, L. Isolation of oxytocic peptides from Oldenlandia affinis by solvent extraction of
tetraphenylborate complexes and chromatography on sephadex LH-20. Lloydia, v. 36, p.
207-208, 1973.
GRUBER, C. W. et al. A novel plant protein-disulfide isomerase involved in the oxidative
folding of cystine knot defense proteins. J Biol Chem, v. 282, n. 28, p. 20435-20446, 2007.
GRUBER, C. W. et al. Distribution and evolution of circular miniproteins in flowering
plants. Plant Cell, v. 20, n. 9, p. 2471-2483, 2008.
GUNASEKERA, S. et al. Chemical synthesis and biosynthesis of the cyclotide family of
circular proteins. IUBMB Life, v. 58, n. 9, p. 515-524, 2006.
GUSTAFSON, K. R. et al. Circulins A and B: Novel human immunodeficiency virus (HIV)-
inhibitory macrocyclic peptides from the tropical tree Chassalia parvifolia. J Am Chem Soc,
v. 113, n. 20, p. 9337-9338, 1994.
HALLOCK, Y. F. et al. Cycloviolins A-D, anti-HIV macrocyclic peptides from Leonia
cymosa. J Org Chem, v. 65, n. 1, p. 124-128, 2000.
HEITZ, A. et al. Solution structure of the squash trypsin inhibitor MCoTI-II: A new family
for cyclic knottins. Biochemistry, v. 40, n. 27, p. 7973-7983, 2001.
HENRIQUES, S. T. et al. Decoding the membrane activity of the cyclotide kalata B1: the
importance of phosphatidylethanolamine phospholipids and lipid organization on hemolytic
and anti-HIV activities. J Biol Chem, v. 286, n. 27, p. 24231-24241.
HENRIQUES, S. T.; CRAIK, D. J. Cyclotides as templates in drug design. Drug Discov
Today, v. 15, n. 1-2, p. 57-64, 2010.
HENRIQUES, S. T.; CRAIK, D. J. Importance of the cell membrane on the mechanism of
action of cyclotides. ACS Chem Biol, v. 7, n. 4, p. 626-636, 2012.
HERNANDEZ, J. F. et al. Squash trypsin inhibitors from Momordica cochinchinensis exhibit
an atypical macrocyclic structure. Biochemistry, v. 39, n. 19, p. 5722-5730, 2000.
HERRMANN, A. et al. The alpine violet, Viola biflora, is a rich source of cyclotides with
potent cytotoxicity. Phytochemistry, v. 69, n. 4, p. 939-952, 2008.
HESLOP-HARRISON, J. S. et al. In situ hybridization with automated chromosome
desnaturation. Technique, v. 3, p. 109-115, 1991.
HUANG, Y. H. et al. The biological activity of the prototypic cyclotide kalata b1 is
modulated by the formation of multimeric pores. J Biol Chem, v. 284, n. 31, p. 20699-
20707, 2009.
IRELAND, D. C. et al. Cyclotides as natural anti-HIV agents. Biopolymers, v. 90, n. 1, p.
51-60, 2008.
IRELAND, D. C.; COLGRAVE, M. L.; CRAIK, D. J. A novel suite of cyclotides from Viola
odorata: sequence variation and the implications for structure, function and stability.
Biochem J, v. 400, n. 1, p. 1-12, 2006.
JENNINGS, C. V. et al. Biosynthesis and insecticidal properties of plant cyclotides: the
cyclic knotted proteins from Oldenlandia affinis. Proc Natl Acad Sci USA, v. 98, n. 19, p.
10614-10619, 2001.
JENNINGS, C. V. et al. Isolation, solution structure, and insecticidal activity of kalata B2, a
circular protein with a twist: do Mobius strips exist in nature? Biochemistry, v. 44, n. 3, p.
851-860, 2005.
KAAS, Q.; CRAIK, D. J. Analysis and classification of circular proteins in CyBase.
Biopolymers, v. 94, n. 5, p. 584-591, 2010.
KAMIMORI, H. et al. Studies on the membrane interactions of the cyclotides kalata B1 and
kalata B6 on model membrane systems by surface plasmon resonance. Anal Biochem, v.
337, n. 1, p. 149-153, 2005.
KENT, S. Novel forms of chemical protein diversity - in nature and in the laboratory. Curr
Opin Biotechnol, v. 15, n. 6, p. 607-614, 2004.
MICHIELS, A. et al. Extraction of high-quality genomic DNA from latex-containing plants.
Anal Biochem, v. 315, n. 1, p. 85-89, 2003.
MULVENNA, J. P. et al. Discovery of cyclotide-like protein sequences in graminaceous crop
plants: ancestral precursors of circular proteins? Plant Cell, v. 18, n.9, p. 2134-2144, 2006.
MULVENNA, J. P.; SANDO, L.; CRAIK, D. J. Processing of a 22 kDa precursor protein to
produce the circular protein tricyclon A. Structure, v. 13, n. 5, p. 691-701, 2005.
MYLNE, J. S. et al. Cyclotides are a component of the innate defense of Oldenlandia affinis.
Biopolymers, v. 94, n. 5, p. 635-646, 2010.
NAIR, S. S. et al. Structural characterization of an unusually stable cyclic peptide, kalata B2
from Oldenlandia affinis. Biochim Biophys Acta, v. 1764, n. 10, p. 1568-1576, 2006.
NGUYEN, G. K. et al. Discovery and characterization of novel cyclotides originated from
chimeric precursors consisting of albumin-1 chain a and cyclotide domains in the Fabaceae
family. J Biol Chem, v. 286, n. 27, p. 24275-24287, 2011a.
NGUYEN, G. K. et al. Discovery of a linear cyclotide from the bracelet subfamily and its
disulfide mapping by top-down mass spectrometry. J Biol Chem, v. 286, n. 52, p. 44833-
44844, 2011b.
NGUYEN, G. K. et al. Discovery of linear cyclotides in monocot plant Panicum laxum of
Poaceae family provides new insights into evolution and distribution of cyclotides in plants. J
Biol Chem, v. 288, n. 5, p. 3370-3380, 2013.
NGUYEN, G. K. et al. Novel Cyclotides and Uncyclotides with Highly Shortened Precursors
from Chassalia chartacea and Effects of Methionine Oxidation on Bioactivities. J Biol
Chem, v. 287, n. 21, p. 17598-17607, 2012.
PEDROSA, A. et al. Characterisation of pericentromeric and sticky intercalary
heterochromatin in Ornithogalum longibracteatum (Hyacinthaceae). Chromosoma, v. 110,
n. 3, p. 203-213, 2001.
PELEGRINI, P. B.; QUIRINO, B. F.; FRANCO, O. L. Plant cyclotides: an unusual class of
defense compounds. Peptides, v. 28, n. 7, p. 1475-1481, 2007.
PERLER, F. B. et al. Protein splicing elements: inteins and exteins - a definition of terms and
recommended nomenclature. Nucleic Acids Res, v. 22, n. 7, p. 1125-1127, 1994.
PICCHI, D. G. et al. Peptídeos cíclicos de biomassa vegetal: características, diversidade,
biossíntese e atividades biológicas. Quím Nova, v. 32, n. 5, p. 1262-1277, 2009.
PINTO, M. F. S. et al. Cyclotides: From Gene Structure to Promiscuous Multifunctionality.
JEBCAM, v. 17, n. 2, p. 40-53, 2011b.
PINTO, M. F. S. et al. Identification and structural characterization of novel cyclotide with
activity against an insect pest of sugar cane. J Biol Chem, v. 287, n. 1, p. 134-147, 2011a.
PLAN, M. R. et al. Backbone cyclised peptides from plants show molluscicidal activity
against the rice pest Pomacea canaliculata (golden apple snail). J Agric Food Chem, v. 56,
n. 13, p. 5237-5241, 2008.
PLAN, M. R. et al. Structural and biochemical characteristics of the cyclotide Kalata B5 from
Oldenlandia affinis. Biopolymers, v. 94, n. 5, p. 647-658, 2010.
POTH, A. G. et al. Cyclotides associate with leaf vasculature and are the products of a novel
precursor in petunia (Solanaceae). J Biol Chem, v. 287, n. 32, p. 27033-27046, 2012.
POTH, A. G. et al. Discovery of an unusual biosynthetic origin for circular proteins in
legumes. Proc Natl Acad Sci USA, v. 108, n. 25, p. 10127-10132, 2011a.
POTH, A. G. et al. Discovery of cyclotides in the fabaceae plant family provides new insights
into the cyclization, evolution, and distribution of circular proteins. ACS Chem Biol, v. 6, n.
4, p. 345-355, 2011b.
QIN, Q. et al. Identification of candidates for cyclotide biosynthesis and cyclisation by
expressed sequence tag analysis of Oldenlandia affinis. BMC Genomics, v. 11, n. 111, p. 1-
11, 2010.
SAETHER, O. et al. Elucidation of the primary and three-dimensional structure of the
uterotonic polypeptide kalata B1. Biochemistry, v. 34, n. 13, p. 4147-4158, 1995.
SAMBROOK, J.; RUSSELL, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. New York:
Cold Spring Harbor Laboratory, 2001.
SANDO, L. et al. A Synthetic mirror image of kalata B1 reveals that cyclotide activity is
independent of a protein receptor. Chembiochem, v. 12, n. 16, p. 2456-2462, 2011.
SASKA, I. et al. An Asparaginyl Endopeptidase Mediates in Vivo Protein Backbone
Cyclization. J Biol Chem, v. 282, n. 40, p. 29721-29728, 2007.
SCHØPKE, T. et al. Hämolyttisch aktive Komponenten aus Viola tricholor L. und Viola
arvensis Murray. Scientia Pharmaceutica, v. 61, p. 145-153, 1993.
SHENKAREV, Z. O. et al. Conformation and mode of membrane interaction in cyclotides.
Spatial structure of kalata B1 bound to a dodecylphosphocholine micelle. FEBS J, v. 273, n.
12, p. 2658-2672, 2006.
SIMONSEN, S. M. et al. A continent of plant defense peptide diversity: cyclotides in
Australian Hybanthus (Violaceae). Plant Cell, v. 17, n. 11, p. 3176-3189, 2005.
SIMONSEN, S. M. et al. Alanine scanning mutagenesis of the prototypic cyclotide reveals a
cluster of residues essential for bioactivity. J Biol Chem, v. 283, n. 15, p. 9805-9813, 2008.
SOUTHERN, E. Southern blotting. Nature Protocols, v. 1, n. 2, p. 518-525, 2006.
SVANGÅRD, E. et al. Cytotoxic cyclotides from Viola tricolor. J Nat Prod, v. 67, n. 2, p.
144-147, 2004.
TAM, J. P. et al. An unusual structural motif of antimicrobial peptides containing end-to-end
macrocycle and cystine-knot disulfides. Proc Natl Acad Sci USA, v. 96, n. 16, p. 8913-8918,
1999.
THONGYOO, P. et al. Chemical and biomimetic total syntheses of natural and engineered
MCoTI cyclotides. Org Biomol Chem, v. 6, n. 8, p. 1462-1470, 2008.
TRABI, M. et al. Circular proteins from Melicytus (Violaceae) refine the conserved protein
and gene architecture of cyclotides. Org Biomol Chem, v. 7, n. 11, p. 2378-2388, 2009.
TRABI, M.; CRAIK, D. J. Tissue-specific expression of head-to-tail cyclized miniproteins in
