Historical Climate Changes in Estonia

A escolha do sítio de ligação é uma etapa crucial em estudos de docking, já que nestas simulações deve ser fornecido corretamente o tamanho e a localização do sítio receptor. Nos casos em que a estrutura tridimensional da enzima complexada com um ligante no sítio a ser estudado estava disponível, este sítio foi configurado para o docking como sendo constituído por todos os resíduos de aminoácido presentes em um raio de 5 Å ao redor de todos os átomos do ligante; este foi o caso do sítio ativo da GRh, sítio ativo do domínio diidrofolato redutase da DHFR-TSPf nativa e mutantes, sítio ativo da DHFRh e sítio do NADH da LDHPf. Este parâmetro foi suficiente, em todos estes casos, para considerar todos os resíduos que delineavam a cavidade onde seria feito o docking.

A estrutura tridimensional da GRPf obtida no PDB (1onf), entretanto, não apresenta ligantes complexados em nenhum dos sítios escolhidos como alvo (sítios ativo e da interface). Desta maneira, a escolha destes sítios receptores dependia, então, de uma comparação desta estrutura com as estruturas das GRs humanas com ligantes complexados nestas cavidades. Para isto, foram feitos alinhamentos sequenciais e estruturais entre a GRh (1gra e 1xan) e a GRPf (1onf) com o objetivo de se escolher corretamente a reentrância onde seriam efetuados os cálculos de docking na GRPf.

O resultado do alinhamento sequencial entre a GRh (1gra) e a GRPf (1onf) aparece na Figura 25. É possível notar que os resíduos catalíticos da GRh (segundo aparece no PDBSum: Cys58, Cys63, Lys66, Tyr197, Glu201, His467’ e Glu472’) são conservados na GRPf. Além disso, a região que envolve as cisteínas catalíticas (Cys58 e Cys63) também aparece bastante conservada, o que está de acordo com outros trabalhos na literatura (MÜLLER et al., 1995). Já os resíduos que compõem o sítio da interface da GRh não são totalmente conservados na GRPf (Fig. 25), o que também já havia sido descrito por outros autores (SARMA et al., 2003).

Na Figura 26, por sua vez, está representado o resultado do alinhamento estrutural feito neste trabalho. As estruturas tridimensionais das enzimas GRh e GRPf são bastante similares entre si, principalmente quando se consideram as hélices α e folhas β (SARMA et al., 2003).

A partir da análise em conjunto das informações obtidas no alinhamento sequencial e na sobreposição destas enzimas, além de dados da literatura (MÜLLER et al., 1995; SARMA et al., 2003), foi possível identificar quais resíduos de aminoácidos são conservados entre as moléculas (aminoácidos da GRh correspondentes na GRPf) e em quais regiões das enzimas ocorrem as substituições de aminoácidos. Assim, foi possível sugerir os sítios de ligação para o estudo de docking na GRPf.

Para o docking no sítio ativo da GRh, considerou-se os aminoácidos presentes em um raio de 5 Å ao redor do substrato GSSG cristalográfico da enzima 1gra (KARPLUS e SCHULZ, 1989). A partir da análise dos resíduos que faziam parte desta cavidade, escolheu-se, baseado nos alinhamentos sequenciais e estruturais da GRh e GRPf, considerar para o docking no sítio ativo da GRPf os resíduos em um raio de 10 Å ao redor dos átomos SG do par Cys39/Cys44 catalítico.

Figura 25 – Alinhamento sequencial pairwise entre as sequências primárias (FASTA) de aminoácidos

da GRh (1gra) e da GRPf (1onf). Em vermelho, aparecem os resíduos catalíticos, conservados entre as enzimas; note como a região ao redor das cisteínas catalíticas é bastante conservada. Dentro das caixas, aparecem alguns dos resíduos que compõem o sítio da interface das enzimas.

Para o sítio da interface da GRh, foram considerados os resíduos dentro de um raio de 10 Å ao redor de um ponto médio entre os átomos NE2 do par His82/His82’ e OE2 de Glu442/Glu442’, de modo a selecionar os aminoácidos que delineavam a cavidade e interagiam com o inibidor XAN na enzima 1xan (SAVVIDES e KARPLUS, 1996). De forma análoga, para o sítio da interface da GRPf considerou-se 15 Å ao redor de um ponto médio entre os átomos OG do par Ser63/Ser63’ e OE2 de Glu459/Glu459’; estes resíduos são correspondentes aos pares His82/His82’ e Glu442/Glu442’ da GRh, identificados por meio dos alinhamentos. Para a GRPf considerou-se uma cavidade maior (15 Å) para permitir que os ligantes buscassem um modo de ligação diferente do XAN, pois sabe-se que a forma desta

reentrância difere entre as duas enzimas e alguns autores defendem que o modo de ligação de inibidores no sítio da interface da enzima do parasita não pode ser deduzido diretamente a partir da análise de complexos formados nesta mesma cavidade da enzima humana (SARMA et al., 2003). Uma comparação entre os sítios da interface da GRh e da GRPf aparece na Figura 27.

Figura 26 – Sobreposição das estruturas tridimensionais das enzimas GRh (azul) e GRPf (dourado).

Note como até mesmo a posição do FAD (setas; um em cada monômero) é conservada entre elas.

Figura 27 – Sítio da interface da GRh (linha grossa e azul) e da GRPf (linha fina e vermelha)

sobrepostos. Os nomes dos resíduos de aminoácidos da enzima humana aparecem em negrito e da enzima do parasita em itálico (somente em um monômero de cada enzima para facilitar a visualização).

Da mesma forma, foram feitos alinhamentos sequenciais e estruturais entre as enzimas LDHPf, M-LDHh e H-LDHh a fim de se escolher corretamente, por comparação, a região do sítio do NADH onde seria feito o docking nas formas humanas da enzima. O resultado do alinhamento sequencial aparece na Figura 28, enquanto que o resultado da sobreposição das estruturas aparece na Figura 29. A partir da análise dos resultados destes alinhamentos, considerou-se para o docking nas LDHs humanas os resíduos de aminoácido presentes em um raio de 10 Å ao redor do ponto médio entre os átomos CG1 da Val52 e CB da Ala95 (na M-LDHh; na H-LDHh os resíduos eram Val53 e Ala96), de modo a incluir nos cálculos todos os resíduos correspondentes aos aminoácidos mais próximos da cloroquina cristalográfica na LDHPf (região onde foi feito o docking na enzima plasmodial).

Figura 28 – Alinhamento das sequências de aminoácidos da cadeia A de M-LDHh (1i10), H-LDHh

(1i0z) e LDHPf (1cet). Em vermelho aparecem os resíduos que ficam próximos à cloroquina na estrutura da LDHPf e seus correspondentes nas enzimas humanas.

Figura 29 – Resultado da sobreposição das enzimas M-LDHh (linha grossa e azul) e LDHPf (linha fina

e vermelha). Estão mostrados somente os resíduos mais próximos à cloroquina (CQH – ligante cristalográfico da LDHPf). Os nomes dos resíduos da enzima humana aparecem em negrito, enquanto os da enzima do P.

falciparum aparecem em itálico.