H ØRINGSUTKAST   2010

sido consistentemente reconhecido por causar efeitos duradouros sobre comportamento (MEHTA; SCHMAUSS, 2011; RHEES; LEPHART; ELIASON, 2001), desenvolvimento físico (DA SILVA HERNANDES et al., 2005), imunidade (MEAGHER et al., 2010), e funções endócrinas (O’MAHONY et al., β011), que podem predispor à obesidade e doenças cardiovasculares, além de doenças neurodegenerativas no adulto (PIENAAR et al., 2008). Estudos também revelam que a manipulação/separação de crias no período neonatal causa estresse emocional e ansiedade nas fêmeas lactantes (AGUGGIA; SUÁREZ; RIVAROLA, 2013). Essa vulnerabilidade é devida, em parte, à criticidade do período pós-natal para o processo de desenvolvimento do cérebro dos roedores (e humanos), que sofre grande influência da plasticidade pós-natal, especialmente dentro de regiões cerebrais específicas, altamente dinâmicas, como o hipocampo, neocórtex, e cerebelo (RICE; BARONE, 2000).

As primeiras semanas de vida dos roedores correspondem aos primeiros dois anos de idade em seres humanos. Insultos nutricionais e outras formas de estresse durante esse período provocam alterações morfológicas no hipocampo e outras regiões do cérebro (FABRICIUS; WÖRTWEIN; PAKKENBERG, 2008), e na sua atividade neuroquímica (DANIELS et al., 2004; GREISEN et al., 2005), afetando a ontogenia do comportamento, com atraso do início da aquisição de reflexos motores (FRANKOVÁ; BARNES, 1968), associado à função do cerebelo (ALAMY; BENGELLOUN, 2012; GEORGIEFF, 2007). Em humanos, traumas e estresse precoce estão associados com redução do volume do hipocampo na vida adulta (porém permanece inalterado na infância) (VYTHILINGAM et al., 2002), além de aumento do risco para ocorrência de desordens psiquiátricas (HEIM; NEMEROFF, 1999; TEICHER et al., 2003).

Os resultados de ganho de peso obtidos nesse estudo estão alinhados com outros trabalhos e apontam para um drástico déficit no desenvolvimento físico dos animais submetidos à SMP, comparativamente ao grupo CNS. Em números gerais, o grupo SMP teve redução de 30,74% do ganho de peso e de 8,69% do comprimento de cauda no ponto final do protocolo experimental. Esses dados estão de acordo com outros estudos, como os realizados por Castro; Rudy (1987), em que os filhotes foram mantidos metade do dia com uma fêmea não-lactante; e por Hernandes et al. (2005), que os mantiveram em uma incubadora. Estes protocolos levaram, respectivamente, a perdas de 40% e 18% de peso corporal. Em um protocolo de desnutrição por competição do leite materno em grandes ninhadas, compostas por 16 crias, sendo 8 no grupo nutrido, Hernandes et al. (2005) encontraram 16% de perda de peso corporal. Em resumo, os dados de trabalhos que estudaram a desnutrição no desenvolvimento físico, demonstraram que as perdas são sempre maiores quando ocorrem após o nascimento, durante a lactação, e durante o mês seguinte ao desmame. Em parte, esse fenômeno pode estar relacionado com o mecanismo de proteção do desenvolvimento durante a vida uterina como, por exemplo, a manutenção do aporte nutricional para o feto mesmo que isso cause perdas para a matriz (PRADO; DEWEY, 2014). Entretanto, é apontado que independente do protocolo experimental utilizado, há recuperação na perda de peso corporal após a realimentação (ALAMY; BENGELLOUN, 2012).

Nesse estudo, os testes comportamentais de correção da posição e imobilidade dorsal indicam que os animais do grupo SMP apresentaram retardo no desenvolvimento desses reflexos. Esse fenômeno foi observado no ponto final (D14) do protocolo experimental, o que pode indicar que os efeitos deletérios da desnutrição pós-natal são acumulativos e ocorrem mais tardiamente. Atrasos no desenvolvimento de alguns reflexos neonatais foram encontrados por Ladd et al. (2010) em um estudo de desnutrição por ninhadas grandes, na segunda semana de vida pós-natal. No mesmo estudo, os autores também encontraram um efeito benéfico da suplementação por acetato de zinco (500mg/L na água de beber dos animais) nos parâmetros comportamentais estudados.

A resposta de imobilidade dorsal (ou imobilidade tônica) é regulada pela substância cinzenta periaquedutal (SCP), uma região localizada ao redor do aqueduto cerebral no interior do mesencéfalo. Esta estrutura possui um papel na modulação descendente da dor e no comportamento defensivo (VIANNA; BRANDÃO, 2003). Estudos demonstram que lesões nessa região causam redução no comportamento defensivo inato (BLANCHARD et al., 2013) e adquirido (LEDOUX et al., 1988). A SCP mantém conexões anátomo-funcionais com estruturas como o tálamo, hipotálamo e amígdala (VIANNA; BRANDÃO, 2003). A SCP se comunica com a amígdala atrás de via recíproca pelo núcleo central. Carrive; Lee; e Su (2000) bloquearam esta via com utilização de lidocaína e observaram uma drástica redução do condicionamento do frio. Entretanto, comprometimento das conexões da SCP com o hipocampo não foram, ainda, reportadas.

A SMP também induziu déficits no reflexo neonatal de correção da posição (surface righting). Esse reflexo parece envolver as vias vestíbulo-cerebelares (ZHANG et al., 2010), sugerindo, dessa forma, que a SMP causa alterações no cerebelo (um órgão de prociocepção inconsciente) que também apresenta um forte componente de desenvolvimento pós-natal. Nesse estudo não avaliamos as alterações morfológicas do cerebelo que podem ter contribuído para esses atrasos na aquisição de reflexos neonatais. Zhang e colaboradores também encontraram déficits no teste de correção de posição em recém-nascidos de fêmeas desnutridas no período de gestação (ZHANG et al., 2010).

Estudos que avaliaram o desempenho cognitivo em camundongos separados por 3 horas durante 15 dias (WANG; JIAO; DULAWA, 2011), e por 24 horas durante 20 dias (FABRICIUS; WÖRTWEIN; PAKKENBERG, 2008), indicam comprometimento da memória espacial e aprendizagem. Resultados semelhantes foram observados em ratos Wistar nos estudos de Lippmann et al. (2007) e Hulshof et al. (2011). No entanto, estes últimos autores não observaram aumento da ansiedade, como foi relatado em outros estudos (MARAIS et al., 2008). Alguns autores, inclusive, relatam que a variedade de resultados em testes comportamentais e de memória são dependentes do sexo dos animais (LEÓN RODRÍGUEZ; DUEÑAS, 2013). Os estudos de Farkas et al. (2009), entretanto,

mostraram que os efeitos comportamentais da separação materna não aparecem no início da vida (ou seja, até 21 dias após o nascimento). Eles realizaram protocolo em ratos Wistar, separados da mãe por 3 horas diariamente do DPN 1 ao DPN14. Os animais foram submetidos a testes de ontogenia do reflexo, condicionamento motor e memória. Esses dados corroboram com os obtidos por Stanton (1992), que não encontrou diferença no desempenho de ratos Wistar separados da mãe por 6 horas diárias durante 16 dias em testes de atividade motora, reconhecimento olfatório e testes de memória.

Barros et al. (2006) desenvolveram uma dieta pobre em proteína e rica em carboidratos, criada com base nas características da dieta do nordestino brasileiro (dieta regional básica) forneceram para ratas lactantes ad libitum. Eles encontraram atrasos da ontogênese de reflexos nas crias amamentadas pelas fêmeas desnutridas. Em camundongos, Belluscio et al. (2014) induziram a desnutrição durante a prenhez e lactação com uma dieta pobre em proteína (9%) que teve a caseína como única fonte proteica. Eles observaram déficits no comportamento social, motivacional e atividade exploratórias em crias independente do sexo. Em um estudo que restringiu o alimento de ratas durante a prenhez (10g) e a lactação (20g), Smart; Dobbing (1971) constataram déficits em 4 de 8 funções reflexas (preensão palmar, susto por estímulo auditivo, correção da posição em queda livre, e posicionamento visual) testadas em recém-nascidos. Em ratos adultos, amamentados por fêmeas que receberam ração hipoproteica (6%), e alimentados com a mesma ração de D21-D49, Fukuda; Françolin-silva; Almeida (2002) concluíram que o aprendizado e sua retenção eram prejudicados nesses animais, no teste de labirinto aquático de Morris.

A diversidade dos resultados na literatura pode ser explicada pelos muitos protocolos de desnutrição empregados, que diferem na intensidade, tempo de separação dos lactentes ou desnutrição materna, além das espécies utilizadas. No entanto, é notório que independente do protocolo estudado, alterações de desenvolvimento físico e comportamental, em menor ou maior grau, são observadas na maioria dos casos e reproduzem o que muitos estudos em humanos têm encontrado (GALLER et al., 2012a).

No Brasil, os estudos realizados pelo grupo do Drs. Aldo Lima e Reinaldo Oriá, em parceria com o Center for Global Health (Virginia – EUA), têm se destacado nessa área. Crianças residentes em áreas com condições precárias de higiene e falta de segurança alimentar apresentam deficiências no crescimento físico e desempenho cognitivo. Foi observado que esses déficits são de longo prazo e permanecem pelo menos até a idade escolar, podendo haver comprometimento do desenvolvimento intelectual e, assim, interferir na inserção social do indivíduo (LIMA et al., 2013, 2014b; LORNTZ et al., 2006; ORIÁ et al., 2010). Nesse contexto, o grupo tem desenvolvido trabalhos que avaliam o papel da intervenção nutricional (LIMA et al., 2013, 2014a) e a influência de polimorfismos genéticos no desenvolvimento de crianças residentes em áreas endêmicas para desnutrição e doenças entéricas em Fortaleza - CE (ORIÁ et al., 2005, 2007, 2010).

Outro achado importante desse estudo foi uma notória redução da imunomarcação para sinaptofisina no hipocampo de camundongos desafiados pela SMP, principalmente no giro denteado. No entanto, não houve diferença significativa da expressão de sinaptofisina (SYN) e da proteína básica de mielina (MBP) no encéfalo total, importantes marcadores de plasticidade neuronal (sinaptogênese e mielinização, respectivamente). Esses achados sugerem um efeito regional, afetando mais o hipocampo que outras regiões do encéfalo. Andersen; Teicher, (2004) realizaram estudo em ratos Wistar separados da mãe por 4 horas diárias durante 18 dias, nas duas primeiras semanas de vida. Os animais foram sacrificados em DPN25, DPN40, DPN60, DPN80 e DPN100 ± 2 dias. Eles observaram que a separação materna precoce reduz os níveis globais de sinaptofisina no hipocampo em relação ao grupo controle não separado/manipulado principalmente a partir de D60, havendo assim uma perda progressiva na densidade sináptica do hipocampo em vez de uma perda brusca precoce. Em animais adultos, a remodelação dendrítica de neurônios hipocampais foi restaurada dentro de 7 a 10 dias após a remoção do fator estressante (MCEWEN, 2000).

Gressens et al. (1997), ao realizaram estudo com uma dieta pobre em proteína (5% de caseína) em ratas grávidas, observaram aumento moderado da

expressão de sinaptofisina nos gânglios da base na prole das fêmeas desnutridas ao nascimento e no DPN 7. Entretanto, eles não foram capazes de encontrar mudanças no neocórtex, hipocampo, tronco cerebral e cerebelo ao longo da primeira e segunda semana do desenvolvimento pós-natal. Monroy; Hernández-Torres; Flores (2010), entretanto, observaram considerável alteração morfológica de dendritos de células neuronais do córtex pré-frontal e hipocampo de filhotes de ratos separados da mãe por 2 horas diárias e durante 12 dias, durante as duas primeiras semanas de vida.

O hipocampo é uma região do cérebro que parece ser particularmente vulnerável aos efeitos do estresse. Essa vulnerabilidade se deve em parte por esta região ter um forte componente de desenvolvimento pós-natal (GIEDD et al., 1996), e também uma elevada densidade de receptores de glicocorticoides. Exposição precoce ao estresse ou corticosteroides pode causar remodelação do hipocampo (ou atrofia) (SAPOLSKY, 2000), que pode estar associada a uma diminuição da arborização dendrítica, vulnerabilidade a um insulto subsequente, e distúrbios na neurogênese (GOULD et al., 2000). Altos níveis de glicocorticoides podem, por exemplo, ter um efeito neurotóxico nas células piramidais do hipocampo (SAPOLSKY; STEIN-BEHRENS; ARMANINI, 1991).

Assim, o estresse provocado pela separação materna precoce parece ter um efeito supressor na superprodução normal de sinapses no hipocampo, sem interferência, porém, em outras regiões como o córtex pré-frontal ou amígdala. Isso sugere que pode haver diferenças regionais importantes nos fatores que regulam a sinaptogênese no sistema nervoso central. As alterações de sinaptofisina provocadas pela separação materna no hipocampo podem, também, representar a primeira evidência da influência ambiental no processo de produção sináptica (e subsequente remodelagem) em um sistema não sensorial. Nesse estudo, não observamos diferença estatística nos níveis séricos de corticosterona (apesar dos níveis serem maiores) nos animais desafiados pela SMP quando comparado ao controle. É importante salientar que medimos os níveis séricos no DPN14, dez dias após o início da separação materna. No final da segunda semana pós-natal, os camundongos costumam ter alimentação mista e não são tão dependentes do leite materno. Talvez as elevações dos níveis de corticosterona sejam mais significativas

nos primeiros dias de separação materna, quando o animal depende muito dos cuidados maternos. Dessa forma, não podemos eliminar a possibilidade de que alterações dos níveis de corticosterona tenham afetado o hipocampo em desenvolvimento. Além disso, esse estudo não considerou efeitos causados pelo sexo que poderia influenciar na sinalização da corticosterona. Mais estudos são necessários para avaliar melhor o papel da corticosterona nesse modelo.

Em humanos, o estresse provocado na infância é relatado como causador de diminuição significativa do volume do hipocampo na vida adulta (BREMNER, 1999; VYTHILINGAM et al., 2002). Alguns estudos realizados em modelos animais têm reproduzido os achados dessas investigações, ou seja, apontando para alterações provocadas pelo estresse neonatal que podem se estender para vida adulta (AKSIC et al., 2013; ANDERSEN; TEICHER, 2004). Nesse estudo verificamos redução significativa da área da camada de células piramidais de CA1 e também na área e volume de CA3. Alterações em outras áreas do hipocampo e no número de neurônios não foram documentadas.

Os estudos que investigam os efeitos da separação materna têm concentrado atenção na observação de alterações morfológicas (e suas consequências) na vida adulta. Num modelo de separação de ratos Wistar por 24 horas no D9, com desmame no D28 e sacrifício com 10 semanas de idade (adultos), Fabricius; Wörtwein; Pakkenberg (2008) observaram perda de 20% de neurônios no GD nos animais desafiados pela SMP em comparação com os controles. Eles também não visualizaram alterações significativas nos volume total e de regiões específicas do hipocampo, bem como no número total de neurônios. Aksic et al. (2013) utilizaram o mesmo modelo de única separação por 24 horas (porém com desmame no D21 e sacrifício em D60) e observaram diminuição no volume do hipocampo (71%) em dos animais expostos à SMP quando comparado ao controle, bem como diminuição no volume das camadas de células piramidal (62%) e granular (60%). Além disso, houve uma diminuição na espessura do córtex pré-frontal, retroesplenial (região imediatamente atrás do esplênio do corpo caloso), e motor, em relação ao grupo controle. Eles também realizaram análise da densidade de neurônios com o

marcador Neu-N, sendo observada redução no córtex pré-frontal e retroesplenial de 70% e 81% respectivamente, ao passo que não houve diferença no córtex motor.

No trabalho de Oreland; Nylander; Pickering (2010) não foram encontradas diferenças significativas nos volumes de CA1, CA2, CA3 e GD de ratos separados por 15 min ou 6 horas durante 21 dias. No entanto, houve menor densidade numérica de neurônios em CA3 e GD e o no número total de neurônios do giro dentado de animais separados, estando nossos dados, assim, parcialmente em desacordo com este estudo, uma vez que a área e o volume de CA3 aparecem alterados em nosso trabalho. No já mencionado estudo de Florian; Nunes (2011) que induziram SM em ratos Wistar por 2, 4, 6, 8, e 10h em D2, D3, D4, D5, e D6 respectivamente, e por 12 horas de D7-D15, foi verificado decréscimo do número de neurônios apenas em CA4. Da mesma forma que esses autores, também não encontramos diferença no total de neurônios nas áreas estudas (CA1, CA3 e GD) do hipocampo. Entretanto, esse mesmo estudo de Florian; Nunes (2011) também investigaram o estresse nutricional pré-natal por restrição alimentar da fêmea lactante e verificaram no DPN 15 que a prole desnutrida apresentava diminuição do número de neurônios em CA2, CA4, e GD.

Estudos que utilizaram outros modelos de privação proteica tanto pré-natal (LISTER et al., 2006) quanto pós-natal (ANDRADE; MADEIRA; PAULA-BARBOSA, 1995) observaram 17% e 33%, respectivamente, redução no volume de CA1, além de perdas irreversíveis de neurônios em 12% e 120%, respectivamente. Em estudo de privação do leite materno por competição (utilizando grandes ninhadas) Ladd et al. (2010), não verificaram alterações na área, volume ou densidade neuronal nas regiões hipocampais. Entretanto, foi observado um aumento do volume dos neurônios de CA1 no grupo desnutrido, que foi atribuído a uma possível degeneração hidrópica (perda do equilíbrio iônico) da membrana celular do neurônio.

Nosso estudo não revelou alterações quanto ao número total de células nas regiões estudas, apesar da redução na área da camada de células piramidais em CA1 e área e volume de CA3. Esses resultados podem parecer conflitantes, pois

como poderia haver redução do volume de uma determinada região sem afetar, pelo menos, o volume das células? Estudos têm demonstrado que quando ocorre diminuição da proliferação celular em modelos de SM ocorre redução da densidade e número total de células, principalmente no GD, o que também pode contribuir para a redução de área/volume de regiões hipocampais (HULSHOF et al., 2011). Provavelmente, fatores como extensão dos prolongamentos neuronais e gliais (pela redução do neurópilo) possam ter sido afetados, influenciado a área/volume das regiões estudadas, sem necessariamente redução no número de células, o que poderia explicar os achados desse estudo. Seria importante em estudos posteriores avaliar a imagem 3D desses neurônios para confirmar essa hipótese.

Assim como discutido em outros dados, observamos uma considerável variedade de resultados nos diversos estudos aqui comparados. Além dos motivos já explanados (diferenças nos protocolos utilizados e o tempo necessário para observação de alterações), outros fatores podem explicar essas diferenças, como por exemplo, os cuidados dispensados pela mãe às crias separadas quando estas retornam ao seu convívio. Estudos têm indicado que a intensidade, a frequência e a duração do cuidado maternal podem ajudar na recuperação das alterações provocadas pelo estresse precoce. Assim, filhotes separados por menos tempo, ou maior frequência de cuidados da mãe (como os do “reaninhamento”) são fatores que devem ser considerados (FRANCIS; MEANEY, 1999; LIU et al., 2000).

Os aminoácidos _{glutamato (Glu), ácido -aminobutírico (GABA), glicina (Gly),} aspartato (Asp), taurina (tau), e D-serina (Ser) são neurotransmissores e neuromoduladores no sistema nervoso central (PERRY; LI; KENNEDY, 2009). O glutamato tanto é um sinalizador crítico na orientação do desenvolvimento do cérebro, como também um mediador importante de comportamentos emocionais e cognitivos relacionados à recompensa no cérebro adulto (LOVINGER; PARTRIDGE; TANG, 2003). Além disso, modula a atividade de eliminação de dendritos e sinapses via ativação do receptor NMDA e o influxo de cálcio em várias regiões do cérebro, como o córtex sensorial-motor (KOZLOWSKI; HILLIARD; SCHALLERT, 1997). Juntamente com o aspartato, são os principais neurotransmissores excitatórios no sistema nervoso central, enquanto o GABA e a glicina são inibidores primários. O

aspartato parece desempenhar um papel neuromodulador além da transmissão excitatória com ambos os enantiômeros (moléculas que são imagens no espelho uma da outra) (PERRY; LI; KENNEDY, 2009). Interessantemente, o GABA tem sido descrito como um neurotransmissor excitatório no cérebro neonatal, tendo um papel na plasticidade sináptica em circuitos do hipocampo (GAÏARSA, 2004), e pode ter papel protetor em modelos de lesão do hipocampo em ratos jovens (AZIMI- ZONOOZ; SHUTTLEWORTH; CONNOR, 2006). A taurina e a D-serina desempenham funções inibitórias como neuromoduladores em receptores de glutamato e GABA (PERRY; LI; KENNEDY, 2009).

O número e distribuição de receptores para neurotransmissores (ALMEIDA; TONKISS; GALLER, 1996), e a neurotransmissão dos sistemas catecolaminérgico, serotoninérgico (WIGGINS; FULLER; ENNA, 1984), glutamatérgico (ROTTA et al., 2003) e gabaérgico (STEIGER et al., 2002, 2003) também são afetados pelo estresse nutricional precoce. Estudos também têm mostrado alteração dos níveis de glutamato, GABA e, em particular, a expressão de seus receptores no hipocampo, como AMPA/NMDA e GABA-A, respectivamente (PICKERING et al., 2006; RYAN et al., 2009). Entretanto, os estudos utilizando modelos de SM têm sido mais consistentes na investigação de alterações no sistema monoaminérgico central. Outro neurotransmissor que é afetado pela SM inclui a noradrenalina, que se mostrou diminuída no córtex cingulado (área associada com a expressão de medo e ansiedade) (ARBORELIUS; EKLUND, 2007). Deficiências nutricionais também têm sido associadas à diminuição do limiar para convulsões experimentais, o que mostra, talvez, uma relação com o distúrbio da neurotransmissão inibitória (HUANG et al., 2003).

Esse estudo foi um dos poucos que investigou a concentração de aminoácidos no hipocampo. A dosagem através do método HPLC demonstrou diminuição da concentração dos aminácidos aspartato, glutamato, glicina e GABA nos animais do grupo SMP comparativamente ao grupo controle CNS. A concentração de taurina não diferiu entre os grupos experimentais. No modelo de Pickering et al. (2006), ratos Wistar machos foram ou separados da mãe durante 15 min ou 6 horas, uma vez por dia entre D1-D21. No hipocampo, a expressão de

RNAm dos receptores de glutamato NMDA (subunidade NR2B) AMPA (subunidades GluR1 e GluR2) foram significativamente mais baixas em ratos separados por 6 horas do que nos controles. Além disso, a expressão do transportador de glutamato GLAST também foi aumentada. Não foram observadas diferenças nos ratos separados por 15 min em relação aos controles, o que indica que os efeitos do hipocampo não foram resultados de manipulação ou cuidados maternos. Para o córtex pré-frontal, não houve diferença na expressão de RNAm para NMDA, NR2A, NR2B, ou AMPA GluR1/GluR2. Eles concluíram que a separação materna prolongada produz alterações neuroadaptativas no hipocampo que pode, pelo menos parcialmente, representar os déficits comportamentais observados anteriormente no mesmo modelo animal utilizado.

Os resultados de Sterley; Howells; Russell (2013) mostram que a SM entre DPN2-DPN14 altera a atividade do GABA-A (canal iônico ativado por ligante, responsável por mediar os efeitos do GABA) no hipocampo. Segundo eles, os resultados indicam que os efeitos do estresse precoce podem ser dependentes da