Grunnleggende om faste, fastetiden og ramadan

Os macrófagos constituem a principal célula de defesa do sistema imune inato na maioria das infecções por microrganismos. Embora muitos trabalhos tenham sido realizados nos últimos anos buscando um melhor entendimento dos mecanismos ativados nestas células durante a interação com patógenos, os estudos se limitaram a um número reduzido de moléculas. Neste sentido a tecnologia de microarranjos abriu uma nova perspectiva ao ampliar o conhecimento em nível molecular das alterações sofridas por estas células durante a interação com o patógeno. Esta tecnologia tem sido aplicada extensivamente principalmente para macrófagos infectados com bactérias patogênicas. Assim, microarranjos de cDNA de macrófagos infectados com a bactéria intracelular Brucella abortus revelaram a indução de genes associados à inflamação de forma semelhante ao observado em experimentos de arranjos que utilizaram outras bactérias intracelulares gram-negativas tais como Salmonella

enterica serovar Typhimurium e Listeria monocytogenes (Rosenberger et al., 2000; Cohen et

al., 2000; Eskra et al., 2003). Recentemente, Weiss et al. (2004) analisaram por microarranjos o padrão sequencial da expressão gênica de macrófagos bovinos incubados com dois diferentes isolados micobacterianos e identificaram genes potencialmente envolvidos na eliminação destes microrganismos. Muitos genes associados a membranas endossomais ou lisossomais foram diferencialmente expressos, por exemplo, verificou-se a indução da expressão gênica de H+ ATPases e a repressão da proteína 2 de macrófago associada ao lisossomo, Src tirosina quinase, proteína de tráfico de vesícula. Além disso, foi observada uma repressão de genes que pró-apoptóticos dos macrófagos induzido por um dos isolados bacterianos, reforçando os estudos funcionais que relataram uma diminuição da porcentagem de apoptose neste mesmo isolado (Weiss et al., 2004). A resposta de células dendríticas e macrófagos humanos a M. tuberculosis e aos protozoários filogeneticamente distintos (Leishmania major, Leishamania donovani, Toxoplasma gondii) e helminto (Brugia malayi) também foi analisada por microarranjos (Chaussabel et al., 2003). Nesta análise, esses autores observaram que na ausência de estímulos desses microrganismos, as células dendríticas e os macrófagos expressam constitutivamente 4.000 genes, sendo que 96% destes são comuns aos dois tipos celulares (macrófagos e células dendríticas). Dessa forma, esta análise revelou a existência de grupos funcionalmente similares de genes que são coordenadamente regulados em ambos os tipos celulares, tais como os relacionados à resposta inflamatória quando estas células são infectadas por L. major e L. donovani. A associação de características funcionais

27 com cada agente infeccioso é consistente com o conceito de que células apresentadoras de antígenos possuem um padrão pré-determinado de sinalização para responder a diferentes patógenos (Chaussabel et al., 2003).

Recentemente, trabalhos avaliando o perfil transcricional de macrófagos durante a infecção com microrganismos baterianos e micobacterianos, foram realizados (Rosenberger et

al., 2000; Cohen et al., 2000; Eskra et al., 2003; Chaussabel et al., 2003; Weiss et al., 2004). No entanto, o número de trabalhos relatando a análise do perfil transcricional de macrófagos infectados por fungos ainda é reduzido. Dentre tais trabalhos realizados recentemente destacam-se aqueles utilizando os fungos oportunistas C. albicans e A. fumigatus (Kim et al. 2005; Cortez et al. 2006). Neste contexto, Kim et al. (2005) analisaram a resposta transcricional de monócitos humanos normais infectados in vitro por C. albicans através de microarranjos de cDNA num período de 0 a 18h de infecção. Nesta análise foi observado aumento da expressão de genes que codificam citocinas proinflamatórias, incluindo TNF-α, IL-1, IL-6, durante as primeiras 6 horas de infecção, que coincidiu com o aumento da fagocitose. A expressão desses genes retornou próximo aos níveis basais em 18 horas de infecção. Genes codificando para quimiocinas, incluindo IL-8, proteínas inflamatórias de macrófagos 1, 3 e 4 e proteína de quimiotração de monócitos também foram fortemente induzidos no intervalo de 4 a 6 horas de infecção, assim como os receptores de quimiocinas CCR1, CCR5, CCR7 e CXCR5. A expressão de genes cujos produtos parecem proteger a viabilidade de monócitos, tais como os relacionados à proteína BCL2, metalotioneínas, CD71, e SOCS3, são induzidos em 4 a 6 horas e permanecem elevados até 18 horas de interação. Dessa forma, a expressão gênica diferencial de monócitos infectados por C. albicans, analisada por microarranjos de cDNA revela a indução de uma cascata dinâmica de expressão de genes cujos produtos são relacionados ao recrutamento, ativação e proteção de monócitos humanos no período inicial de infecção. Adicionalmente, com o objetivo de analisar a cinética inicial de expressão gênica de monócitos humanos infectados com conídios de A. fumigatus, Cortez et al. (2006) também utilizaram a tecnologia de microarranjos de cDNA. Nesta análise, os autores verificaram a indução de genes codificando citocinas e quimiocinas envolvidas na defesa do hospedeiro contra A. fumigatus, incluindo IL-1α, IL-8, CXCL-2, CCL-4, CCL-3 e CCL-20, de 2 a 6 horas de co-cultivo, que coincide com aumento na fagocitose. Além disso, observou-se que o gene que codifica para CD14 foi reprimido, e os genes codificando para IL- 10 e metaloproteinase 1 de matriz foram induzidos.

28 Vale ressaltar que não existem na literatura até o momento dados de análise global e da cinética de interação relativos à expressão gênica diferencial do hospedeiro, por microarranjos de cDNA, em função dos processos de infecção pelos patógenos fúngicos P.brasiliensis e

H.capsulatum, objeto deste estudo.

2. JUSTIFICATIVA

As células de defesa do hospedeiro, em especial os macrófagos desempenham funções muito importantes no estabelecimento e desenvolvimento da PCM e histoplasmose. Apesar disso, poucos estudos foram realizados para analisar as alterações de expressão gênica em resposta a infecção por P. brasiliensis e H. capsulatum. Os trabalhos publicados são, em sua maioria, relacionados aos genes específicos que codificam para moléculas de defesa relacionadas às citocinas e moléculas relacionadas à fagocitose. Diferentemente, vários estudos, utilizando modelos de infecção microbiana, vêm aplicando tecnologia genômica para verificar mudanças no perfil transcricional na interação hospedeiro-patógeno.

Este trabalho de doutorado propõe-se pela primeira vez analisar o perfil cinético global de expressão gênica coordenada das moléculas do macrófago em resposta aos fungos patogênicos P. brasiliensis e H. capsulatum. Adicionalmente, com base nos dados de expressão gênica do P. brasiliensis recuperado do interior do macrófago, conduzido em paralelo a este trabalho em nosso grupo (Tavares et al., 2007), foi possível analisar as alterações em nível molecular, ocorridas no macrófago e no P. brasiliensis, em 6 horas da interação patógeno-hospedeiro. Os resultados obtidos no presente trabalho são pioneiros no que se refere à análise em larga escala da expressão gênica na interação patógeno-hospedeiro em fungos. Dessa forma, estes estudos irão ampliar o entendimento do processo infectivo destes dois importantes patógenos, P. brasiliensis e H. capsulatum, além de fornecer as bases moleculares de conhecimento para o desenvolvimento de novas estratégias no tratamento destas duas micoses sistêmicas.

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3. OBJETIVO

Analisar a cinética da expressão gênica global de macrófagos infectados com

brasiliensis ou H. capsulatum.

3.1. Metas

1- Analisar a expressão diferencial global e temporal dos genes de macrófagos durante a interação macrófago-P. brasiliensis por microarranjos de cDNA; quantificação das citocinas secretadas pelos macrófagos por ELISA e validação da expressão diferencial de genes dos macrófagos chaves por PCR em tempo real; 2- Analisar a expressão diferencial global e temporal dos genes de macrófagos

durante a interação macrófago-H. capsulatum por microarranjos de cDNA e quantificação das citocinas secretadas pelos macrófagos por ELISA;

3- Realizar uma análise comparativa da resposta do hospedeiro frente à infecção causada pelos dois patógenos;

4- Propor um modelo de eventos que ocorrem em nível molecular durante a interação

P. brasiliensis-macrófago, em decorrência dos dados obtidos neste trabalho de resposta dos macrófagos e dados do nosso grupo relativos à resposta de expressão gênica do patógeno após internalização pelos fagócitos.

4. METODOLOGIA