Segundo a sua capacidade de penetrar nas células, Hammerstedt et al. (1990) classificaram os crioprotetores em externos (não penetrantes) ou internos (penetrantes). Os principais crioprotetores penetrantes empregados para a criopreservação do sêmen equideo são: glicerol, etilenoglicol, propilenoglicol, dimetilsulfóxido, acetamida, dimetilformamida e a metilformamida (Keith, 1998; Oliveira, 2005; Canisso, 2008). Os crioprotetores não penetrantes são os açucares, lipoproteínas da gema de ovo, proteínas do leite, metilcelulose, pentoxifilina, dentres outros (Keith, 1998; Moussa et al., 2002). Os efeitos das macromoléculas no processo de resfriamento do sêmen foram descritos no tópico anterior. Os crioprotetores não penetrantes exercem sua ação no meio externo, aumentando a porcentagem de água sem congelar à baixas temperaturas e assim, reduzindo a concentração de sais nestes canais de água (Amann e Pickett, 1987).
Os crioprotetores penetrantes atuam substituindo a água intracelular, reduzindo o estresse osmótico causado pela desidratação, mantendo o volume celular e diminuindo seu ponto de congelação. Apesar de ser o
crioprotetor mais utilizado para a criopreservação do sêmen, o mecanismo exato pelo qual o glicerol protege as células dos danos causados pelo congelamento – descongelamento não está totalmente compreendido. Entretanto, Amann e Pickett (1987) sugeriram que a atuação maior do glicerol seria extracelular. No entanto, está claro que o glicerol é capaz de permear a membrana plasmática e exercer o efeito no interior do citoplasma. Além dos efeitos osmóticos, o glicerol parece também ter efeitos diretos sobre a membrana plasmática. Desta forma, algumas evidências sugerem que o glicerol se liga diretamente aos fosfolípides de membrana, reduzindo a sua fluidez, podendo ainda interagir com proteínas ligadoras na membrana e glicoproteínas, formando agrupamentos de partículas intramembrana (Armitage, 1986; citado por Parks e Graham, 1992).
A adição de crioprotetores permeantes aos diluidores utilizados para o resfriamento do sêmen tem efeitos diferentes de acordo com a espécie. Na espécie bovina, a inclusão de glicerol no diluidor a base de leite prolongou a viabilidade espermática, quando os espermatozóides foram mantidos sob resfriamento à 5ºC. Com isso, aumentou-se o tempo de armazenamento de dois para mais de quatro dias, acompanhado por uma taxa de concepção satisfatória (Almquist e Wickersham, 1962). Na espécie equina, o efeito da adição de 7% de glicerol ao diluidor utilizado para o resfriamento do sêmen foi estudado por Demick et al. (1976). As taxas de concepção ao primeiro ciclo obtidas foram de 38,9 e 5,6% para o sêmen resfriado a 5°C por duas horas na presença ou ausência de glicerol, respectivamente, havendo diferenças (p<0,05) entre os tratamentos.
Bedford et al. (1995) avaliaram o comportamento do sêmen equino submetido a quatro tratamentos: 1) diluído em diluidor a base de leite em pó desnatado–glicose (LPDG), 2) diluído em diluidor LPDG acrescido de 4% de gema de ovo (LPDG– GO), 3) diluído em diluidor LPDG acrescido de 4% de glicerol (LPDG–G) e 4) diluído em
diluidor LPDG acrescido de 4% de gema de ovo e 4% de glicerol (LPDG–GOG). Após 24 e 48 horas de armazenamento a 5ºC, as menores médias de motilidade progressiva foram observadas no tratamento 2 (LPDG– GO). Às 48 horas de armazenamento, a motilidade progressiva foi superior para o tratamento contendo apenas o glicerol (LPDG–G). Entretanto, adição de glicerol ao diluidor seminal, embora não tenha afetado a motilidade espermática, afetou negativamente a fertilidade.
Assim, em um segundo experimento, a fertilidade por ciclo, baseada na taxa de recuperação embrionária sete dias após a ovulação, foi de 50% (12/24) para as éguas inseminadas com sêmen diluído em diluidor a base de leite desnatado-glicose, 17% (4/24) para às inseminadas com sêmen submetido à remoção do plasma seminal, diluído no mesmo diluidor anterior acrescido de 4% de gema de ovo e de 13% (3/24) para éguas inseminadas com diluidor acrescido de 4% de glicerol (Bedford et al., 1995).
O aumento das concentrações de glicerol (0; 2,2; 3,5; e 4,8%) no diluidor utilizado para o resfriamento do sêmen equino resultou em queda progressiva da taxa de concepção em éguas (87, 53, 53 e 13%; p<0,01; Vidament et al., 2005).
Com base nos resultados de literatura, observa-se que a adição de crioprotetores permeantes aos diluidores para resfriamento do sêmen equino se mostra prejudicial a fertilidade obtida, sendo sua utilização restrita ao processo de congelamento do sêmen. Com raras exceções, as células de mamíferos são incapazes de sobreviver ao congelamento a temperaturas ao redor de -20°C, quando suspensas em fluidos teciduais ou soluções salinas. (Mazur, 1980). Assim, os crioprotetores permeantes são essenciais para a sua sobrevivência durante o processo de criopreservação, podendo, entretanto, em altas concentrações, terem efeitos adversos sobre as células (Fahy, 1986). Por isso, deve- se estabelecer um equilíbrio entre a
concentração mínima necessária para conferir proteção às células durante o processo de criopreservação, e a concentração máxima que não exerça efeitos tóxicos sobre as mesmas (Amann e Pickett, 1987; Graham, 1996).
Apesar de o glicerol ser o crioprotetor mais utilizado para a criopreservação do sêmen de diversas espécies domésticas e selvagens tem apresentado alta toxicidade. Seus efeitos negativos foram observados não somente sobre a motilidade espermática pós- descongelamento, mas também na fertilidade das fêmeas inseminadas. Efeito contraceptivo foi atribuído ao glicerol nas espécies equídeas (Bedford et al., 1995; Vidament et al., 2005, 2009), embora tenha sido mais pronunciado na espécie asinina (Vidament et al., 2009), tanto para o sêmen resfriado quanto para o congelado.
Hammerstedt e Graham (1992) relataram efeitos nocivos do glicerol sobre as células espermáticas, provavelmente resultantes de mudanças no citoplasma ocasionadas pelo aumento da viscosidade intracelular, decorrente da presença deste crioprotetor, que, por sua vez, altera a polimerização da tubulina e a associação dos microtúbulos. Outros efeitos adversos, tais como mudanças no balanço bioenergético, alteração da membrana plasmática e mudanças no glicocálix têm sido atribuídas ao glicerol. Para o desenvolvimento de um banco de sêmen, envolvendo jumentos da raça Poitou, Trimeche et al. (1998) utilizaram um diluidor contendo 10% de gema de ovo de codorna, 80mM de glutamina e 4% de glicerol para o congelamento do sêmen. Observaram que o diluidor possibilitou motilidade total e progressiva aceitáveis, bem como preservou a integridade das membranas espermáticas, nuclear e acrossomal. A glutamina pareceu exercer efeito crioprotetor adicional ao glicerol. Entretanto, quando da utilização deste sêmen para a inseminação de jumentas da mesma raça, gestações só foram obtidas quando o sêmen foi diluído em diluidor a base
de leite, após o descongelamento, previamente à inseminação.
A proteína canal Aquaporina 7, presente na membrana espermática de diferentes espécies, têm sido incriminada como possível rota de penetração do glicerol para o meio intracelular. A presença e a quantidade desta proteína explicariam, em parte, as diferenças entre espécies quando da utilização do glicerol como crioprotetor (Curry, 2000). Assim, Dalmau (2003) e Castejón (2005) observaram melhores resultados, quanto à criopreservação das células espermáticas de jumentos, quando a concentração de glicerol não excedeu os 2,5%.
Estudos mais recentes têm sido desenvolvidos com a utilização de diversos crioprotetores para o sêmen equino, sendo que as amidas, associadas ou não ao glicerol, apontaram para resultados mais favoráveis (Alvarenga et al., 2005; Snoeck et al., 2007). Entretanto para o sêmen asinino os resultados ainda são conflitantes (Dalmau, 2003; Alvaréz et al., 2004).
Ao trabalhar com o congelamento do sêmen de jumentos da raça Zamorano-Leonés, Dalmau (2003) observou que os tratamentos envolvendo o etilenoglicol, resultaram em menor porcentagem de células espermáticas apresentando motilidade total e progressiva, comparados aos que utilizaram o glicerol. Já Alvaréz et al. (2004) observaram superioridade da utilização da dimetil formamida como crioprotetor em relação ao glicerol, quanto à manutenção da motilidade e integridade das membranas plasmáticas e acrossomal de espermatozóides asininos criopreservados.
No mesmo sentido, Oliveira (2005) comparou a associação entre diferentes crioprotetores para o congelamento de sêmen asinino, a saber: dimetilsulfóxido (DMSO), dimetil formamida (DF), dimetilacetamida (DA) e glicerol (GL), na composição dos diluidores utilizados para o congelamento de sêmen asinino. Os tratamentos foram: M1 (2% DMSO + 2% DF), M2 (3% DF), M3 (2% DA
+ 2% GL), M4 (3% DA), M5 (3% GL + 2% DF) e M6 (3% DMSO % + 2% GL). Como pontos finais, avaliou-se as motilidades total e progressiva, que variaram de 61,8 a 69,4% e 36,5 a 46,5%, respectivamente, bem como a porcentagem de células espermáticas com membrana integra, que variou 41,1 a 48,6%. Para estes parâmetros, não se observou diferenças (p>0,05) entre os tratamentos. No teste de fertilidade não foram obtidas gestações após a inseminação de 56 jumentas. Entretanto, ao utilizar apenas o diluidor M6, obteve-se uma taxa de concepção de 40% após a inseminação de 10 éguas com sêmen asinino congelado (Oliveira, 2005).
Os efeitos do glicerol sobre a fertilidade de jumentas inseminadas com sêmen asinino fresco diluído, diluído e resfriado ou congelado foram estudados por Vidament et al. (2005). Para tal, foram realizados três experimentos: no primeiro trabalho, compararam a fertilidade de jumentas inseminadas com sêmen asinino submetido à quatro tratamentos diferentes antes das inseminações: I) diluição em leite UHT; II) centrifugação, ressuspensão em leite UHT e resfriamento à 4°C por 1h 15min; III) centrifugação, ressuspensão em diluidor INRA82® acrescido de 2% de gema de ovo (INRA82-Y) e resfriamento à 4°C por 1h 15min e IV) centrifugação, ressuspensão em diluidor INRA82-Y + 2,5% de glicerol e resfriamento a 4°C por 1h 15min. As taxas de concepção por ciclo foram de 85,71% (6/7); 77,78% (7/9); 62,5% (5/8) e 0% (0/8) para os tratamentos na ordem em que foram descritos, podendo-se observar os efeitos devastadores do glicerol sobre a fertilidade do sêmen utilizado em jumentas.
No segundo experimento, avaliou-se o efeito do crioprotetor utilizado sobre a taxa de concepção em fêmeas asininas inseminadas com sêmen centrifugado e diluído em diluidor INRA-Y: I) sem adição de crioprotetor; II) +2,5% de glicerol; III) +2,5% de dimetiliformamida ou IV) +2,5% de etilenoglicol, sendo as amostras submetidas, posteriormente, ao resfriamento a 4°C por 1h 15min. As taxas de concepção por ciclo foram
de 63,64% (7/11); 8,3% (1/12); 66,67% (8/12) e 45,45% (5/11) para os tratamentos I, II, III e IV, respectivamente, demonstrando-se que, de forma contrária ao glicerol, a dimetilformamida e o etilenoglicol não interferiram com a fertilidade do sêmen resfriado armazenado por um curto período. No terceiro experimento, o congelamento do sêmen asinino foi realizado utilizando-se o diluidor INRA82-Y acrescido de 2,5% de glicerol (TI) ou 2,5% de dimetilformamida (TII). A motilidade pós-descongelamento não diferiu entre os tratamentos (54 e 47%, respectivamente). Entretanto, diferentemente do que se observou no sêmen resfriado, a dimetilformamida resultou em baixa taxa de concepção (10,53%) quando da inseminação de jumentas, que não diferiu da observada para o sêmen congelado, na presença de glicerol (0%).
Em estudo posterior, Vidament et al. (2009) compararam a fertilidade de fêmeas das espécies equina e asinina, inseminadas com sêmen de jumentos. A inseminação das fêmeas com sêmen asinino diluído em leite UHT e resfriado a 4°C, resultou em taxas de concepção, ao primeiro ciclo, similares para as duas espécies (45%). Já a utilização do sêmen congelado contendo 2,2% de glicerol resultou em diferentes taxas de concepção para éguas e jumentas (36% e 11%, respectivamente), apesar da motilidade similar pós-descongelamento, do sêmen utilizado para inseminar as éguas ou jumentas (56%). Esta discrepância entre boa motilidade e baixa fertilidade observada para o sêmen congelado de jumentos, encontra suporte no trabalho conduzido por Oliveira (2005). Assim, ao utilizar diferentes combinações de crioprotetores, demonstrou que o glicerol é efetivo para a manutenção da motilidade espermática pós-descongelamento.Entretanto, parece ser prejudicial à fertilidade, principalmente quando da inseminação de fêmeas asininas.