mistura de secreções testiculares, do epidídimo e das glândulas acessórias, cujas funções são fornecer energia e proporcionar um meio adequado para o movimento e sobrevivência dos espermatozóides enquanto migram pelo sistema genital feminino até o local onde acontecerá a fertilização (Mann, 1964).
Aproximadamente 95% do volume total do ejaculado do garanhão é secretado pelas glândulas sexuais, representadas pela vesícula seminal, próstata, glândula bulbouretral e ampolas dos ductos deferentes (Pickett et al., 1983). Em estudo conduzido por Contri et al. (2008), foi realizada a avaliação ultrassonográfica das glândulas sexuais acessórias (vesícula seminal, próstata,
glândula bulbouretral e ampola dos ductos deferentes) em 16 jumentos da raça Martina- Franca nos períodos de repouso sexual, ereção e após a ejaculação. O aumento no tamanho das glândulas após a estimulação sexual, bem como a sua redução após a ejaculação foram significativas (P ≤ 0,01) em todas as glândulas. Exceção apenas para a vesícula seminal quando apenas a redução após a ejaculação foi significativa (P ≤ 0,01). O tamanho de todas as glândulas avaliadas não diferiu (P>0,05) entre as mensurações realizadas em repouso sexual e após a ejaculação.
Similarmente ao observado em equinos por Weber et al. (1990), o diâmetro e a aparência ultrassonográfica das glândulas sexuais nos asininos não esteviveram associados às características seminais envolvendo o volume total e livre de gel do ejaculado ou a concentração espermática (Contri et al., 2008).
Diferindo do que foi descrito para garanhões, no estudo de Contri et al. (2008) o lúmen das vesículas seminais não foi detectado em nenhuma das avaliações realizadas em jumentos. As dimensões das glândulas sexuais foram maiores quando comparadas às de garanhões (Mari e Belluzzi, 1992). Segundo os autores, este fato pode ser atribuído ao alto volume do ejaculado livre de gel obtido para o sêmen de jumentos (89,1±38,5 mL) comparado ao descrito para garanhões (28 – 65 mL; Squires et al., 1979). Os espermatozóides dos mamíferos são liberados do testículo ainda incapazes de interagir com o oócito, somente adquirindo capacidade fecundante após sofrer um complexo processo denominado maturação espermática pós-testicular. Esse processo inicia-se durante o trânsito epididimário, sendo seguido por mudanças que ocorrem durante a ejaculação. No sistema genital feminino, os espermatozóides são submetidos a uma segunda sequência de maturação, denominada capacitação, que os permite atingir o local da fertilização e interagir com o oócito de maneira adequada. O plasma
seminal parece exercer importantes funções nestes processos (Töpfer-Petersen et al., 2005).
Uma característica essencial do processo de maturação pós-testicular inclui o remodelamento da superfície dos espermatozóides através de interações específicas com proteínas e glicoproteínas, secretadas ao longo do epidídimo e também presentes no plasma seminal. Proteínas com capacidade ligante aos espermatozóides estão envolvidas no estabelecimento do reservatório espermático (Gwathmey et al., 2003), no controle da capacitação espermática pela atuação conjunta de fatores decapacitantes e capacitantes (Manjunath e Thérien, 2002) e em eventos centrais da fertilização (Töpfer- Petersen et al., 1999ab).
Para manter a integridade da membrana, durante o transporte pelo sistema genital feminino, as proteínas do plasma seminal se aderem à membrana espermática, formando uma camada de glicoproteínas. Os espermatozóides, ao passarem do plasma seminal para os fluidos do sistema genital feminino, sofrem algumas alterações, tais como remoção ou modificação da camada glicoprotéica (Gadella et al., 2001), alteração do fluxo iônico transmembrana, exposição dos sítios de receptores da membrana espermática, remoção dos componentes que cobrem a cauda, evitando que haja restrição da motilidade hiperativa do flagelo. Outras mudanças também ocorrem nas porções caudal e rostral da cabeça do espermatozóide, precedendo a reação acrossômica; e nas peças intermediária e principal, antecedendo a hipermotilidade (Amann e Graham, 1993). O painel de proteínas identificadas no plasma seminal inclui hormônios, enzimas, inibidores de proteinases e outros componentes, fatores de crescimento protéicos e glico-protéicos, de natureza e função ainda desconhecidas. Sua composição e efeitos na capacidade fertilizante dos espermatozóides parecem variar dependendo da fertilidade individual (Brandon et al., 1999). Entretanto, apenas em casos restritos a ação do plasma seminal sobre
a função espermática foi atribuída à presença de uma ou mais proteínas distintas (Töpfer- Petersen et al., 2005).
O conteúdo de proteínas do plasma seminal do equino, aproximadamente 10mg/mL, é relativamente baixo quando comparado ao de outras espécies mamíferas (20 a 60mg/mL). Além disso, parece variar em função das frações do ejaculado, de forma que Koskinen et al. (2002) registraram maior conteúdo protéico na fração rica em espermatozóides, no ejaculado de equinos. Também variações individuais foram observadas em relação a este conteúdo protéico.
No que diz respeito ao plasma seminal asinino, não há relatos na literatura quanto à sua composição protéica. As distinções já relatadas entre o plasma seminal equino e asinino concentram-se na menor quantidade de magnésio (Morais et al., 1994b) e maior conteúdo de frutose (Trimeche, 1996), triglicérides e proteínas totais (Pal et al., 2009) no plasma seminal de asininos.
As proteínas presentes no plasma seminal equino tendem a formar agregados com massa molecular de aproximadamente 800 kDa, sendo estes compostos principalmente por proteínas de peso molecular entre 11-30 kDa, que correspondem a 70% do total de proteínas seminais (von Fellenberg et al., 1985). Proteínas com peso molecular entre 13 e 122 kDa foram detectadas por Amann et al. (1987). Ap utilizarem eletroforese bidimensional, Brandon et al. (1999) identificaram 14 proteínas principais, estando algumas delas correlacionadas com a fertilidade individual dos garanhões.
Alguns estudos têm descrito proteínas no plasma seminal bovino associadas a diferentes funções espermáticas como motilidade e viabilidade (Baas et al., 1983), responsáveis pela variação de fertilidade entre touros (Killian et al., 1993; Moura et al., 2006) e facilitadoras da capacitação espermática (Miller et al., 1990; Manjunath e Thérien, 2002). Também na espécie equina, o plasma seminal contêm fatores capazes de
estimular ou deprimir a motilidade espermática (Varner et al., 1987). Assim, a adição de plasma seminal aos espermatozóides equinos obtidos do epidídimo provocou um aumento imediato da motilidade espermática (Braun et al., 1994). A caracterização estrutural das principais proteínas presentes no plasma seminal equino foi iniciada por Calvete et al. (1994). As proteínas isoladas, designadas proteínas do plasma seminal equino (em inglês HSP), numeradas de 1 a 8, possuem massa molecular entre 14 e 30kDa. Com exceção da HSP–4, as demais proteínas apresentaram propriedades ligantes às células espermáticas e puderam ser isoladas dos espermatozóides ejaculados.
Em algumas espécies mamíferas, as proteínas do plasma seminal foram isoladas através de suas propriedades de ligação à heparina. Em bovinos e equinos, a heparina se liga aos espermatozóides ejaculados modulando o processo de capacitação (Miller et al., 1990; Varner et al., 1993). Apesar de os fatores passíveis de influenciar a capacidade dos espermatozóides equinos sofrerem reação acrossômica ainda não terem sido identificados, alguns autores sugerem que os efeitos específicos da heparina sobre os espermatozóides possam ser mediados, in vivo, pelas proteínas seminais com propriedades ligantes à heparina (Manjunath e Therién, 2002). HSP-1, HSP-2 e HSP-5 a 8, demonstraram capacidade de se ligarem à heparina e de se associarem à superfície espermática, indicando uma participação potencial no processo de fertilização (Töpfer- Petersen et al., 2005).
As proteínas HSP-1 e HSP-2 são as mais abundantes no plasma seminal equino, respondendo por 70 – 80% do conteúdo total. Pertencentes à família das pequenas proteínas seminais do tipo Fn2 (Calvete et al., 1995), correspondem às grandes proteínas ligadoras de heparina do plasma seminal bovino (BSPs). A capacidade das proteínas do tipo Fn2 de se ligarem às células espermáticas é mediada por interações específicas com os
lipídios colina presentes na membrana espermática (Müller et al., 1998).
A HSP-3 é membro da família de proteínas secretórias ricas em cisteína (CRISP), sendo sua presença descrita em diversas espécies. Inicialmente identificada no epidídimo de ratos, uma componente desta família demonstrou contribuição no processo de fusão entre o espermatozoide e o oócito (Ellerman et al., 2002). Em algumas espécies, incluindo a equina, foi demonstrado que a expressão dos genes dessa família está sob controle androgênico (Schambony et al., 1998; Jalkanen et al., 2005). No espermatozóide equino, as proteínas tipo CRISP foram localizadas na região equatorial, pós-acrossomal e também na peça intermediária do espermatozóide. Sua associação com a superfície espermática se inicia no corpo do epidídimo (Schambony et al., 1998). Mesmo após lavagem com soluções salinas, verificou-se que um número definido de moléculas CRISP permanece firmemente aderido à membrana espermática. Vale salientar que Reineke et al. (1999) demonstraram estar este número de moléculas CRISP diretamente relacionado à fertilidade individual de garanhões.
A HSP-4 está relacionada a produtos do gene da calcitonina. Em humanos e murinos foi possível estabelecer uma correlação entre a concentração de calcitonina no plasma seminal e a motilidade espermática (Mungan et al., 2001). Além disso, tem sido estabelecido seu efeito na prevenção da super – capacitação e reação acrossômica espontânea através da atuação via adenilato ciclase/ cAMP (Fraser et al., 2005).
As HSP-6 e HSP-8 são diferentes isoformas de uma mesma proteína, pertencente à família de proteínas similares à calicreína, com alto grau de homologia ao antígeno prostático humano (PSA). A HSP-7 representa a proteína equina homóloga à espermadesina AWN que, na espécie suína, parece estar envolvida no estabelecimento do reservatório espermático, capacitação e interação espermatozoide - zona pelúcida. Demonstrou-
se, ainda, a capacidade da HSP-7 em se ligar à zona pelúcida de oócitos equinos intactos, o que sugere uma possível participação desta proteína na interação espermatozóide – zona pelúcida (Reinert et al., 1997). A HSP-7 foi detectada em espermatozóides isolados dos testículos sugerindo sua origem testicular. Durante a sua passagem pelos ductos epididimários, quantidades adicionais de HSP-7 se ligam à superfície espermática, principalmente no segmento equatorial. No ejaculado equino, a concentração total de proteínas é menor na fração pré-espermática, sendo maior na fração rica em espermatozóides (Koskinen et al., 2002). Quando as proteínas foram isoladas e identificadas no ejaculado fracionado, a maior parte das proteínas do plasma seminal foram HSP-1, HSP-2 e HSP-4 e estavam presentes nas três frações estudadas, embora com variações quantitativas significativas entre os garanhões. Diferenças foram observadas entre as frações, quanto à quantidade de HSP-2, estando as maiores concentrações na fração rica em espermatozóides (Kareskoski et al., 2005).
Outros componentes menores do plasma seminal equino têm sido descritos, dentre eles: a lactoferrina (Inagaki et al., 2002), a leptina e fatores de crescimento, cujos conteúdos foram associados à longevidade espermática (Champion et al., 2002) e outras enzimas como a lipase (Carver e Ball, 2002), α1,4- glucosidase (Dias et al., 2004), bem como a enzima conversora de angiotensina (Ball et al., 2003).
O plasma seminal é uma rica fonte de antioxidantes com potencial de proteger os espermatozóides do ataque oxidativo durante a estocagem. Em humanos, demonstrou-se que o plasma seminal reduz os danos causados pelas espécies reativas ao oxigênio, diminuindo a ocorrência de fraturas nas moléculas de DNA e a peroxidação dos lipídios (Potts et al., 2000).
Quando em baixas concentrações, os radicais livres, tais como o ânion superóxido (O2-), o
peróxido de hidrogênio (H2O2) e o óxido nítrico (NO2), em sua maioria originados de atividade metabólica normal dos espermatozóides, têm um papel importante na função espermática, especificamente na fosforilação da tirosina (De Lamirande et al., 1997). Eles podem induzir a hiperativação, capacitação e reação acrossômica. Todavia, quando em altas concentrações são prejudiciais à célula espermática (Ball et al., 2001).
Ball et al. (2001) apontam para a importância do estresse oxidativo, causado pelas espécies reativas ao oxigênio (ROS), sobre a função espermática do sêmen preservado por longo período. Os autores sugerem que a H2O2 seja a espécie reativa ao oxigênio mais nociva aos espermatozóides, responsável pela perda da motilidade espermática. O plasma seminal possui sistemas de remoção ROS, sendo a enzima catalase um destes sistemas (Ball et al. 2001). Assim, Koskinen et al. (2002) relataram melhor sobrevivência espermática na presença de maiores concentrações de catalase.
Raijmakers et al. (2003) quantificaram a glutationa–tripeptídeo, co-fator para a glutationa peroxidase e glutationa S transferase, que aponta para uma função protetora contra danos oxidativos. Observaram, ainda, maiores concentrações no plasma seminal de machos férteis. Além disso, verificaram que a motilidade, bem como a morfologia dos espermatozóides foram superiores na presença de maiores concentrações de glutationa.
Na fração rica em espermatozóides foram encontradas altas concentrações de - glucuronidase (BG), o que corresponde à sua possível origem testicular ou epididimária (Kareskoski et al., 2006). Juntamente com outras enzimas, foi demosntrado na espécie bovina, que a BG acrossômica participa da dispersão das células do cumulus (Rethinaswamy et al., 1994).
Pesch et al. (2006) determinaram as concentrações de diversas enzimas do plasma
seminal equino, verificando a sua correlação com as variáveis utilizadas para a avaliação rotineira do sêmen. A enzima lactato desidrogenase (LDH) mostrou ser um importante fator atuando na função e metabolismo espermáticos, estando fortemente correlacionada com o volume de sêmen, a concentração espermática, o percentual de espermatozóides vivos e mortos e a patomorfologia. As concentrações de fosfatase alcanina (FA) e fosfatase ácida (FAC), aspartato aminotransferase (AAT) e - glutamiltransferase (GGT) foram negativamente correlacionadas com o volume de sêmen, embora estivessem positivamente correlacionadas com a concentração espermática, o que poderia indicar, de certa forma, a sua origem testicular ou epididimária.
As concentrações de GGT e LDH também foram correlacionadas com as motilidades espermáticas total e progressiva. A atividade da AAT e o conteúdo protéico total do plasma seminal mostraram-se correlacionados com a congelabilidade do sêmen equino (Bittmar e Kosiniak, 1992).
Em um estudo comparando as características seminais de garanhões da raça Marwari e jumentos franceses, Pal et al. (2009) observaram que as concentrações de glutamato-oxaloacetato-transaminase (GOT), lactato desidrogenase (LDH), proteínas e triglicérides totais foram superiores no plasma seminal de reprodutores asininos. Correlações significativas foram estabelecidas entre as concentrações de GOT e a porcentagem de espermatozóides vivos e móveis no sêmen de bovinos (Roussel e Stallcup, 1965). A origem da GOT foi demonstrada ser epididimária em ovinos (Alumot e Schindler, 1965) e prostática em humanos (Eliasson, 1966). As quantidades de diferentes eletrólitos e elementos traços variam entre as diferentes frações do plasma seminal, existindo diferenças entre garanhões quanto à concentração de alguns desses componentes. As concentrações de cálcio, fosfato inorgânico e magnésio foram maiores na
fração rica do ejaculado (Kareskoski et al., 2005). No garanhão, aproximadamente 60- 75% do cálcio total encontrado no plasma seminal é ionizado, sendo a sua concentração positivamente correlacionada com o volume do ejaculado, de modo que as glândulas sexuais acessórias têm sido responsabilizadas como as principais contribuintes do elemento no plasma seminal (Kareskoski e Katila, 2008).
As concentrações de ferro, zinco e cobre foram negativamente correlacionadas com o volume de sêmen, embora as concentrações de ferro e zinco estivessem também correlacionadas à concentração espermática. As concentrações de ferro e cobre variaram entre as amostras normais e nas apresentando decréscimo da qualidade espermática (Pesch et al., 2006).
As frações contendo fluido pré-espermático apresentaram maiores concentrações de cloro e sódio (Kareskoski et al., 2005), o que poderia afetar a sobrevivência espermática durante o armazenamento (Padilla e Foote, 1991; Kareskoski et al., 2006). Assim, a inclusão de fluido pré-espermático nas doses inseminantes deveria ser evitada, uma vez que não beneficia a motilidade espermática durante o armazenamento, além de não contribuir para o aumento da concentração espermática (Katila et al., 2004).
O potássio é outro eletrólito presente no plasma seminal que têm importância na regulação de algumas funções metabólicas dos espermatozóides. Padilla e Foote (1991) observaram que o sêmen resfriado de garanhões foi melhor preservado quando centrifugado e adicionado potássio e outros íons ao meio diluidor a base de leite.
Troedsson et al. (1998) observaram que quando o sêmen era depositado no útero de éguas, ocorria uma rápida perda de espermatozóides pela vagina, que era maior quando utilizava-se sêmen diluído ou descongelado. Assim, os autores acreditaram que o plasma seminal poderia exercer alguma
influência sobre a permanência dos espermatozóides no sistema genital feminino. Estudos in vitro sugerem que o plasma seminal protege os espermatozóides do ataque dos polimorfonucleares (PMN), o que facilitaria seu transporte no sistema genital da égua (Troedsson et al., 2000). Posteriormente, testes in vivo realizados pelo mesmo grupo de pesquisadores demonstraram que em éguas com endometrite induzida, após inoculação com espermatozóides mortos, a fertilidade foi prejudicada pela remoção do plasma seminal. Desta forma, a concepção foi de 77% (17/22) para éguas inseminadas com espermatozóides suspensos no plasma seminal, sendo de apenas 5% (1/22) nas éguas inseminadas com espermatozóides suspensos em diluidor (Alghamdi et al., 2004).
No ambiente uterino normal, livre de inflamação, a presença do plasma seminal parece ser desnecessária. Neste sentido, Rigby et al. (2001) inseminaram éguas com espermatozóides centrifugados ressuspensos em diluidor contendo 0 ou 20% de plasma seminal. As taxas de concepção não diferiram, sendo de 76% (13/17) e 72% (13/18), respectivamente. Resultados similares foram obtidos por Katila et al. (2004), quando observou-se taxas de concepção idênticas (62%) para éguas inseminadas na presença ou ausência de plasma seminal.
Kotilainen et al. (1994) demonstraram que o plasma seminal induziu forte influxo de neutrófilos para o lúmen uterino. Fiala et al. (2002) por sua vez, demonstraram que o plasma seminal estimulou uma resposta inflamatória mais exacerbada que o diluidor de sêmen a base de leite. Entretanto, quando o plasma seminal foi utilizado, a reação inflamatória uterina teve menor duração. Provavelmente, este potencial do plasma em reduzir a duração da resposta inflamatória só se expresse na ausência de espermatozóides. Evidência experimental, neste sentido, foi demonstrada por Barreto (2007), quando observou-se que a resposta inflamatória teve a mesma duração, independentemente da
presença ou não das proteínas do plasma seminal.
2.1.1.4. Composição bioquímica das