4.1.5.1 Efeito da modulação do efluxo de K+ por 20 mM de KCl na resposta vasodilatadora do NTHF
Na presença de 20 mM de KCl, o efeito vasorrelaxante induzido por NTHF
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 0 25 50 75 100
FEN (Endotélio removido) ODQ 10 M *** Log [NTHF] M % Re la xa me n to
Envolvimento da via do NO na resposta vasodilatadora induzida pelo NTHF em artéria mesentérica superior de rato 59
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Figura 16), sugerindo uma possível participação dos canais para K+ na resposta vasorrelaxante do NTHF.
Figura 16 – Efeito da elevação da concentração de K+ para 20 mM na resposta vasodilatadora do NTHF em anéis mesentéricos. Curva concentração-resposta do efeito vasorrelaxante induzido pelo NTHF (1 pM-10 µM), em anéis mesentéricos sem endotélio funcional e pré- contraídos com FEN 10 µM, na ausência (quadrado azul; n = 12) ou presença de KCl 20 mM
(círculo azul; n = 8); **p < 0,01
4.1.5.2 Efeito do bloqueio dos canais de K+ pelo TEA na resposta vasodilatadora do NTHF
Um efeito similar ao dos experimentos realizados na presença da solução com 20 mM de KCl foi observado após o bloqueio dos canais de potássio com TEA 3 mM (Emáx = 38 ± 8,3%, p < 0,0001; pD2 = 7,36 ± 0,35; n = 7; Figura 14B) ou 1 mM (Emáx = 31 ± 5,0%, p < 0,0001; pD2 = 7,72 ± 0,30; n = 7; Figura 17), quando comparado ao controle (Emáx = 100 ± 6,1%; pD2 = 7,39 ± 0,15). -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 0 25 50 75 100
FEN (Endotélio removido) KCl 20 mM % Re la xa me n to ** Log [NTHF] M
Figura 17 – Efeito do bloqueio do TEA na resposta vasodilatadora do NTHF em anéis mesentéricos. Curva concentração-resposta do efeito vasorrelaxante induzido pelo NTHF
(1 pM-10 µM), em anéis mesentéricos sem endotélio funcional e pré-contraídos com FEN 10 µM, na ausência (quadrado azul; n = 12) ou presença de TEA 3 mM (círculo preto; n = 7) ou
1 mM (círculo verde; n = 7); ***p < 0,0001
4.1.5.3 Efeito de diferentes bloqueadores de canais para K+ na resposta vasodilatadora do NTHF
Na presença de bloqueadores específicos de canais para K+, como: 4-AP 1 mM (Emáx = 81 ± 8,5%; e pD2 = 7,41 ± 0,19; n = 8; Figura 15A), GLIB 10 µM (Emáx = 97 ± 9,0%; e pD2 = 7,32 ± 0,24; n = 6; Figura 15C) e BaCl2 30 µM (Emáx = 94 ± 4,9%; e pD2 = 7,36 ± 0,35; n = 5; Figura 15D), não houve alteração na resposta vasorrelaxante produzida pelo NTHF, quando comparada ao controle (Emáx = 100 ± 6,1%; e pD2 = 7,39 ± 0,15). -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 0 25 50 75 100
FEN (Endotélio removido) TEA 3 mM TEA 1 mM % Re la xa me n to *** *** Log [NTHF] M
Envolvimento da via do NO na resposta vasodilatadora induzida pelo NTHF em artéria mesentérica superior de rato 61
Maria do Carmo de Alustau s
Figura 18 – Efeito de bloqueadores específicos de canais para K+ na resposta vasodilatadora do NTHF em anéis mesentéricos. Curva concentração-resposta do efeito vasorrelaxante
induzido pelo NTHF (1 pM-10 µM), em anéis mesentéricos sem endotélio funcional e pré-contraídos com FEN 10 µM, na ausência (quadrado azul; n = 12) ou presença de: A) 4-AP 1 mM (círculo dourado; n = 8); B) GLIB 10 µM (círculo vinho; n = 6); ou C) BaCl2 30 µM (círculo
róseo; n = 5) -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 0 25 50 75 100 4-AP 1 mM
FEN (Endotélio removido)
A) Log [NTHF] M % Re la xa me n to -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 0 25 50 75 100 BaCl230 M
FEN (Endotélio removido)
C) % Re la xa me n to Log [NTHF] M -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 0 25 50 75 100 GLIB 10 M
FEN (Endotélio removido)
B) % Re la xa me n to Log [NTHF] M
4.1.6 Investigação do desenvolvimento de tolerância vascular pelo NTHF
O pré-tratamento dos anéis mesentéricos com 10 μM de NTHF não alterou a sensibilidade para respostas subsequentes deste nitrato em estudo (Emáx = 95 ± 6,7%; e pD2 = 7,01 ± 0,17), quando comparado ao controle (Emáx = 99,7 ± 6,1%; e pD2 = 7,40 ± 0,15), que não recebeu o tratamento (Figura 20).
Figura 19 – Efeito do tratamento com NTHF (10 µM) durante 60 minutos na resposta vasodilatadora deste nitrato em anéis mesentéricos. Curva concentração-resposta do efeito
vasorrelaxante induzido pelo NTHF (1 pM-10 µM), em anéis mesentéricos sem endotélio funcional e pré-contraídos com FEN 10 µM, antes (quadrado azul; n = 12) ou após o tratamento
com 10 μM de NTHF (círculo lilás; n = 6)
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 0 25 50 75 100
FEN (Endotélio removido)
NTHF 10 M Emáx = 95 6,7% pD2 = 7,01 0,17 Emáx = 100 6,1% pD2 = 7,40 0,15 Log [NTHF] M % Re la xa me n to
Envolvimento da via do NO na resposta vasodilatadora induzida pelo NTHF em artéria mesentérica superior de rato 63
Maria do Carmo de Alustau Tabela 1 – Valores de pD2 e Emáx para NTHF sob diferentes condições experimentais em anéis
de artéria mesentérica
Condição experimental pD2
(-LogEC50)
Emáx
(% Relaxamento)
FEN (endotélio intacto) 7,86 ± 0,22 84 ± 5,3 * FEN (endotélio removido) 7,39 ± 0,15 100 ± 6,1
KCl 80 mM 6,56 ± 0,12 ** 49 ± 3,8 *** L-NAME 100 µM 6,62 ± 0,15 ** 85 ± 9,9 NAC 3 mM 8,32 ± 0,18 ** 89 ± 6,2 HDX 30 µM 6,73 ± 0,28 * 66 ± 9,2 Carboxi-PTIO 300 µM 7,97 ± 0,37 32 ± 6,2 *** CIAN 1 mM 8,61 ± 0,50 * 29 ± 9,5 ODQ 10 µM 9,10 ± 0,41 *** 22 ± 4,6 *** KCl 20 mM 6,92 ± 0,34 59 ± 9,5 ** TEA 3 mM 7,72 ± 0,35 31 ± 5,0 *** TEA 1 mM 7,36 ± 0,30 38 ± 8,3 *** 4-AP 1 mM 7,41 ± 0,19 81 ± 8,5 GLIB 10 µM 7,32 ± 0,24 97 ± 9,0 BaCl2 30 µM 7,36 ± 0,35 94 ± 4,9 NTHF 10 µM (tolerância vascular) 7,01 ± 0,17 95 ± 6,7
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5 DISCUSSÃO
O NTHF, um nitrato orgânico obtido em uma reação de rendimento satisfatório, por meio da utilização do bagaço da cana-de-açúcar, que é gerado em grande quantidade por usinas, foi objeto deste estudo, com a finalidade de investigar uma possível ação vascular deste composto e o mecanismo de ação envolvido nesta resposta. O desenvolvimento deste estudo demonstrou que o NTHF induz resposta vasorrelaxante, de maneira independente do endotélio vascular, provavelmente, por ativação da NOS e da ALDH, com uma possível liberação de NO, a ativação da sGC e um efeito modulatório sobre os canais para potássio, o BKCa.
O crescente conhecimento do envolvimento do NO em diversas vias biorregulatórias tem despertado o interesse terapêutico por nitratos orgânicos e outros doadores de NO, como também intensificado o uso destes compostos em estudos farmacológicos. Entretanto, a via que leva à formação de NO difere significantemente entre as classes individuais destes compostos e suas reatividades químicas. Os doadores de NO tem efeito na hemodinâmica sistêmica e no fluxo sanguíneo local, sendo este efeito dependente da habilidade relativa destes compostos para relaxar vasos de resistência e condutância (FEELISCH, 1998).
Baseado nestes fatos, a investigação da ação vascular do NTHF foi realizada em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato. Este nitrato produziu um potente efeito vasorrelaxante (~10-8 M), de maneira dependente de concentração, na presença do endotélio vascular, em anéis pré-contraídos com FEN (10 μM), um agonista dos receptores α1-adrenérgicos, (BYLUND, 1992; BÜSCHER et al., 1999).
O endotélio é o maior regulador da homeostase vascular local, não apenas por regular a permeabilidade vascular, mas também por regular o calibre dos vasos sanguíneos de acordo com as demandas hemodinâmicas e hormonais, mantendo, assim, a fluidez do sangue (BRUTSAERT, 2003; FÉLÉTOU; VANHOUTTE, 2006). As células endoteliais executam estas funções pela expressão, ativação e liberação de potentes substâncias, como também por estímulos físicos e químicos (mudanças na pressão, estresse por cisalhamento e pH) (FÉLÉTOU; VANHOUTTE, 2006; INAGAMI; NARUSE; HOOVER, 1995). Entre as substâncias liberadas pelo endotélio
estão os fatores: relaxantes, como: adenosina, fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF), prostaciclina (PGI2) e o NO; e os contracturantes, como: tromboxano A2 (TXA2), ânion superóxido (O2-.) e endotelina-1 (ET-1; FURCHGOTT; VANHOUTTE, 1989; LÜSCHER; VANHOUTTE, 1986; VANHOUTTE; FÉLÉTOU; TADDEI, 2005).
Devido à importância destes fatores liberados pelo endotélio no controle do tônus vascular, foram realizados experimentos em anéis mesentéricos sem endotélio funcional, nos quais o efeito vasorrelaxante do NTHF não foi potencializado, mas apresentou uma maior eficácia, sugerindo que os fatores relaxantes derivados do endotélio vascular não estão envolvidos na resposta vasodilatadora do nitrato orgânico em estudo (Figura 9). A partir desta comprovação, todos os protocolos experimentais subsequentes foram realizados na ausência do endotélio vascular.
A contração do músculo liso vascular é regulada pela concentração do Ca2+ intracelular e pela sensibilidade dos elementos contráteis a este cátion. Neste mecanismo, o Ca2+ se liga à CaM, ativando a cinase da cadeia leve da miosina (MLCK), que fosforila MLC, e esta interage com os filamentos de actina para promover a contração (KARAKI; SATO; OZAKI, 1991; SAKAMOTO et al., 2003).
As contrações induzidas por FEN, em células de músculo liso, ocorrem por meio da ativação dos receptores α1-adrenérgicos, acoplados à proteína Gq/11. Estas contrações são mediadas por um aumento no influxo de Ca2+, tanto por meio de canais operados por receptor (LEE et al., 2001a) como por canais dependentes de voltagem (ECKERT et al., 2000; LEE et al., 2001b), além da mobilização do Ca2+ dos estoques intracelulares. Outra maneira de induzir vasoconstrição é por aumento das concentrações extracelulares de K+, que causa despolarização da membrana, por impedir o efluxo destes íons, e gera abertura dos Cav, resultando em influxo deste íon e consequente contração muscular. (INTERAMINENSE et al., 2007; WANG et al., 2008). Alguns estudos mostram que tanto a contração mediada por receptor como a promovida pela alta concentração de K+ extracelular envolvem a ativação da proteína cinase dependente do complexo RhoA-GTP (ROCK), que fosforila a subunidade de ligação da miosina na MLC fosfatase, inativando a sua atividade de remover o fosfato da MLC, contribuindo para manutenção da contração (KARAKI et al., 1997; SAKAMOTO et al., 2003; SOMLYO; SOMLYO, 1994).
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Diante disso, foram realizados experimentos nos quais os anéis mesentéricos foram pré-contraídos pela solução de Tyrode modificada com 80 mM de KCl. Frente a esta solução despolarizante, o vasorrelaxamento do NTHF foi atenuado de maneira significativa, com redução da eficácia e da potência. Este resultado sugere que a via comum entre a solução despolarizante com 80 mM de KCl e da FEN, ativação dos CaV e envolvimento da via da ROCK, não está, totalmente, implicada no efeito vasodilatador do nitrato orgânico em estudo.
O vasorrelaxamento mediado por doadores de NO é conhecido por ser mediado pela liberação de NO, na sequência da biotransformação do tecido-alvo (PACHER; BECKMAN; LIAUDET, 2007). É descrito na literatura que o NO é um importante regulador homeostático do tônus vascular (WANSTALL et al., 2001; MONCADA; HIGGS, 2006), e que a sua deficiência tem um papel em numerosas condições e estados patológicos como na hipertensão e no vasoespasmo (MONCADA; HIGGS, 2000; REES; HIGGS; MONCADA, 2000).
A maioria do NO produzido ocorre por meio de uma reação enzimática a partir da NOS (STUEHR, 1997). Além das células endoteliais (POLLOCK et al., 1991), a eNOS tem sido descrita nos músculos cardíaco e esquelético (FÖRSTERMANN et al., 1995). Já a nNOS, além de ser encontrada no sistema nervoso, foi identificada na camada média do músculo liso vascular de artérias carótidas bovinas (BROPHY et al., 2000), em aorta de ratos (SCHWARZ; KLEINERT; FÖRSTERMANN, 1999), artéria uterina de ovelha (SALHAB et al., 2000) e no leito vascular mesentérico (SULLIVAN et al., 2002).
Foram desenvolvidos protocolos experimentais na presença do L-NAME (100 μM), um análogo da L-arginina, que inibe a produção de NO via NOS (REES et al., 1990), nos quais o efeito vasorrelaxante do NTHF foi reduzido, com diminuição da sua eficácia e da potência, sugerindo que ambas formas constitutivas podem estar envolvidas no vasorrelaxamento deste nitrato orgânico.
É ressaltado que existe uma forte relação entre a geração de ROS e a sinalização de NO, regulando seus comportamentos de forma mútua (THOMAS et al., 2008). A reação do NO com as ROS resulta no sequestro de NO, bem como na produção de intermediários associados com efeitos indiretos (THOMAS et al., 2006).
Neste contexto, foi desenvolvido um protocolo experimental, utilizando o NAC 3 mM, um tiol, precursor farmacológico da L-cisteína e doador exógeno de grupos sulfidrils (ABRAMS, 1991), que atua sequestrando ROS (FAVOROLO; KEMP-HARPER, 2007). Este tiol potencializou a resposta vasorrelaxante do NTHF, corroborando com estudos que mostraram que o NAC pode potencializar os efeitos de nitratos (MÜNZEL et al., 1989; WINNIFORD et al., 1986), além de sugerir uma possível produção de NO, pelo fato de que os tióis serem conhecidos por potencializarem a ação deste gás, tanto por formar mais ativos biologicamente ativos como por prevenir a degradação de oxidação do NO, já que a propriedade S-nitrosotiol do NO, parece ser o principal intermediário na ação deste gás (ANDREWS; PRASAD; QUYYUMI, 2001).
Tem sido aceito que os nitrovasodiltadores, incluindo os nitratos orgânicos, causam vasodilatação por meio da biotransformação liberando o NO (ARTZ et al., 2002). Os nitratos orgânicos, em geral, podem ser metabolizados por diferentes vias de bioativação, que parecem diferir entre altas e baixas concentrações nestes compostos (MÜNZEL; DAIBER; MÜLSCH, 2005). Os nitratos de baixa potência são bioativados por enzimas P450 no retículo endoplasmático, produzindo diretamente NO. Entretanto, os nitratos com alta potência, geralmente concentrações relevantes clinicamente (< 1 μM), são bioativados pela ALDH, que com sua atividade redutase converte os nitratos orgânicos a NO2- e ao metabólito denitratado correspondente (DE LA LANDE et al., 2004; IGNARRO, 2002; MÜNZEL; DAIBER; MÜLSCH, 2005).
Ao utilizar a cianamida 1 mM, um inibidor inespecífico da ALDH (MÜNZEL; DAIBER; MÜLSCH, 2005), a resposta vasorrelaxante do NTHF foi fortemente atenuada, com redução da sua eficácia, sugerindo a participação desta enzima na possível produção de NO pelo nitrato orgânico em estudo, uma vez que o NO pode ser formado a partir do NO2-, por catálise da cadeia respiratória mitocondrial (CHEN et al., 2005; CHEN; ZHANG; STAMLER, 2002)
Outra forma de avaliar a produção de NO, é por meio da utilização de sequestradores da forma radicalar deste gás, como a hidroxicobalamina e o carboxi-PTIO. A hidroxicobalamina é uma ferramenta adicional para investigar processos fisiológicos mediados pelo NO• (RAJANAYAGAM; RAND, 1993), funcionando por meio da ligação do seu átomo cobalto ao NO, convertendo-se à
Envolvimento da via do NO na resposta vasodilatadora induzida pelo NTHF em artéria mesentérica superior de rato 69
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O carboxi-PTIO é um radical estável que oxida o NO para gerar dióxido de nitrogênio (NO2) e 2-fenill-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil (PTI) (Figura 18) (GOLDESTEIN; RUSSO; SAMUNI, 2003; MILLAR; THIEMERMANN, 2002). Este radical é um sequestrador da forma radicalar do NO (AKAIKE et al., 1993), bloqueando a resposta para o NO• exógeno (HOBBS; TUCKER; GIBSON, 1991; RAND; LI, 1995b).
Figura 20 – Reação do carboxi-PTIO com o NO, formando o iminonitróxido correspondente Fonte: Goldstein; Russo; Samuni, 2003
Após a utilização destes dois sequestradores de NO•, foi observado que o relaxamento promovido pela adição cumulativa do NTHF apresentou uma significante atenuação, com resposta máxima de 66 (HDX) e 32% (carboxi-PTIO), sugerindo que a resposta vasodilatadora do composto em estudo, provavelmente, envolve a formação do NO•, corroborando com os resultados anteriores que indicam a participação deste gás a partir do NTHF.
Os resultados apresentados, em conjunto, reforçam a hipótese de que o NTHF deve exercer a sua resposta vasodilatadora por meio da liberação de NO, provavelmente na forma radicalar, no músculo liso vascular, e que esta liberação envolve a participação de algumas enzimas, como a NOS e a ALDH. Para confirmar esta proposta, será necessária a realização de protocolos experimentais adicionais, para medida da produção de NO em tempo real.
Uma ferramenta crucial nas ações fisiológicas do NO in vitro é a ativação da sGC (McDONALD; MURAD, 1995; PACHER; BECKMAN; LIAUDET, 2007; WALDMAN; MURAD, 1988), uma proteína heterodimérica, que cataliza a conversão de GTP a cGMP (ARTZ et al., 2002), e o grau desta ativação depende de quais das formas de NO (NO•, NO- ou NO+) predomina (WANSTALL et al., 2001; TSENG;
TABRIZI-FARD; FUNG, 2000), pois tem sido reportado que apenas o NO• pode ativar esta enzima (DIERKS; BURSTYN, 1996).
Para avaliar a participação das sGC, foi utilizado o ODQ 10 µM, um inibidor desta enzima. Após a pré-incubação dos anéis mesentéricos com este inibidor, o vasorrelaxamento do NTHF foi fortemente atenuado, com uma significante redução da eficácia do NTHF, tendo apenas 22% de relaxamento máximo, sugerindo que a resposta vasodilatadora deste nitrato orgânico é mediada pela ativação desta enzima, além de corroborar com a hipótese de que a forma de NO que esta sendo liberada provavelmente é a radicalar.
O aumento dos níveis de cGMP, gerado pela ativação da sGC, modula vários processos intracelulares (BOLOTINA et al., 1994), via ativação de seus efetores downstream, PKG (ROBERTSON et al., 1993; TANIGUSHI; FURUKAWA; SHIGEKAWA, 1993), e canais iônicos operados por nucleotídeos cíclicos (ZACCOLO; MOVSESIAN, 2007), incluindo a abertura de BKCa (ACHER et al., 1994). Uma das principais consequências da ativação da PKG em células do músculo liso vascular é o vasorrelaxamento, o qual é mediado pela fosforilação de proteínas que regulam os níveis do Ca2+ intracelular, como também a sensibilidade da maquinaria contrátil e pelo aumento da atividade de canais para K+ (TAKAHASHI et al., 2008). Admite-se, também, que o NO possa ativar diretamente canais para K+, de maneira independente do cGMP (BOLOTINA et al., 1994).
Sabendo desta importância da participação dos canais para K+ na regulação do tônus vascular, fomos investigar se estes canais estariam envolvidos na resposta vasodilatadora do NTHF. Quando os anéis foram pré-incubados com solução de Tyrode com 20 mM de KCl e pré-contraídos com FEN, a resposta da adição cumulativa do NTHF foi atenuada, com deslocamento da curva para direita, e uma significante redução do efeito máximo para, aproximadamente, 60%. Esta diminuição do efeito vasodilatador do nitrato, juntamente com a atenuação da resposta (~50%) após indução da contração com 80 mM de KCl, sugerem que o efeito vasorrelaxante deste nitrato orgânico, provavelmente, envolve a participação de canais para K+, pois dados da literatura mostram que compostos vasodilatadores, cujos mecanismos são dependentes de canais para K+, apresentam uma perda de seus efeitos quando expostos a soluções com alta concentração de K+, pelo fato de que esse aumento
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tornando, assim, o mecanismo de ativação destes canais ineficaz (KHAN; HIGDON; MEISHERI, 1998; MENEZES et al., 2007).
Para reforçar esta hipótese, foi utilizado o TEA 3 mM, que nesta concentração comporta-se como um bloqueador não seletivo de canais para K+ (WANG et al., 2008). Quando os anéis foram pré-incubados com este bloqueador, a resposta do NTHF foi atenuada, com redução do efeito máximo para 30%, confirmando a suposição de que os canais para K+ estão implicados no efeito vasodilatador deste nitrato.
Diante deste fato, fomos avaliar quais dos quatro tipos de canais para K+ identificados no músculo liso vascular estaria participando desta resposta vasodilatadora deste nitrato. Para esta finalidade foram utilizados bloqueadores seletivos para cada canal (BKCa, KV, KATP e KIR).
É bem relatado que o TEA, em concentrações menores do que 1 mM, atua bloqueando os BKCa de maneira seletiva (LANGTON et al., 1991). Após a pré-incubação dos anéis mesentéricos, com 1 mM deste bloqueador, a resposta vasodilatadora do NTHF foi atenuada de forma similar (38%) ao observado com o TEA 3 mM, sugerindo que o tipo de canais para K+ que podem estar envolvidos na resposta vasorrelaxante do NTHF é o BKCa.
Para avaliar a participação dos outros canais para K+ encontrados no músculo liso vascular, foram utilizados bloqueadores seletivos para os outros canais: a 4-AP 1 mM, um bloqueador dos KV (CÔRTES et al., 2001; OKABE; KITAMURA; KURIYAMA, 1987); a GLIB 10 µM, um bloqueador dos canais para K+ sensíveis ao ATP (BEECH; BOLTON, 1993; XU; LEE, 1994); e o BaCl2 30 µM, um bloqueador seletivo para KIR (ADARAMOYE; MEDEIROS, 2009; ROBERTSON; BONEV; NELSON, 1996). Após a pré-incubação individual destes bloqueadores seletivos, o vasorrelaxamento, promovido pela adição das concentrações cumulativas do NTHF, não apresentou alterações, sugerindo que os canais KV, KATP e KIR, provavelmente, não estão envolvidos na resposta vasodilatadora do nitrato em estudo. Além disso, estes resultados corroboram para proposição de que o BKCa seja o canal para K+ envolvido no efeito do NTHF.
Esta possível participação dos BKCa na resposta vasodilatadora do nitrato orgânico em estudo é bastante importante, devido ao fato de que uma variedade de recentes estudos suportam a importância dos BKCa na regulação do tônus vascular e
da PA., dando uma base racional sólida para a utilização de ativadores seletivos destes canais na prevenção e no tratamento de doenças cardiovasculares (LEDOUX et al., 2006).
Apesar dos nitratos orgânicos serem excelentes agentes para o tratamento de doenças cardiovasculares, o seu uso é limitado pelo fato da maioria destes compostos desenvolverem a tolerância vascular (MÜNZEL; DAIBER; MÜLSCH, 2005). Os mecanismos básicos para o desenvolvimento da tolerância vascular por nitratos permanecem insuficientemente definidas e são, provavelmente, de origem multifatorial (DAIBER et al., 2009a). Recentemente, foi descrido que o mecanismo de tolerância desempenhado por nitratos orgânicos envolve a diminuição da sua bioativação (DAIBER et al., 2009b), devido à inativação da ALDH (CHEN et al. 2002; IGNARRO, 2002), desensibilização da sGC (WALDMAN et al., 1986), aumento da atividade de fosdodiesterases (BOHYN; BERKENBOOM; FONTAINE, 1991) e produção vascular de superóxido (MÜNZEL et al., 1995).
Muitas abordagens experimentais têm sido utilizadas para avaliar a tolerância. Em modelos in vitro, o tecido vascular é incubado com altas concentrações do nitrato orgânico e, então, são utilizadas medidas funcionais ou bioquímicas (DIFABIO et al., 2003).
Baseado no protocolo descrito por Difabio et al. (2003), foi investigado se o NTHF causa tolerância vascular após os anéis mesentéricos serem incubados durante 60 minutos com a concentração de 10 μM, que promove o efeito máximo deste nitrato. Após os anéis passarem por este tratamento, não foram observadas alterações significativas em relação aos anéis que não passaram por este tratamento. Este resultado sugere que a concentração máxima do NTHF utilizada neste estudo não desenvolve tolerância vascular após uma exposição prolongada a este nitrato. Este resultado é de imensa importância para este estudo, baseado no fato de que todos os nitratos orgânicos estudados até a atualidade, a exceção singular é o tetranitrato de pentatritil (PETN), que exibe tolerância consideravelmente menor do que todos os outros (MÜLLENHEIM et al., 2001). Porém, outros protocolos experimentais precisam ser desenvolvidos tanto para investigar o envolvimento do NTHF na tolerância vascular in vitro como in vivo.
6 CONCLUSÃO
De acordo com os resultados obtidos neste estudo, pode-se concluir que:
O NTHF promove um efeito vasodilatador em anéis de artéria mesentérica superior de ratos, de maneira independente dos fatores relaxantes derivados do endotélio vascular;
Esta resposta vasodilatadora envolve produção de NO•, que ocorre, possivelmente, por meio do envolvimento da NOS e biotransformação do nitrato em estudo a partir da ALDH;
Há ativação da sGC, provavelmente, como consequência da liberação do NO•;
Este efeito vasorrelaxante parece envolver a ativação de BKCa;
O nitrato orgânico em estudo não desenvolve tolerância vascular após exposição prolongada à concentração de 10 μM do NTHF, a maior utilizada neste estudo.
Detalhar o mecanismo de ação envolvido no efeito vasodilatador do NTHF, avaliando seu efeito sobre:
correntes para K+, em miócitos de artéria mesentérica recém-dispersos, por meio da técnica eletrofisiológica de Patch-clamp, para confirmar os