A análise de microssatélite também denominado STR (Short Tandem Repeats) é uma técnica que tem como alvo a variabilidade genética do T. cruzi e baseia-se na amplificação por PCR de fragmentos de DNA contendo repetições curtas (1-6pb), dispersos no genoma dos eucariotos. Devido a sua abundância, dispersão no genoma e alto grau de polimorfismo de
tamanho, os microssatélites são considerados como poderosos marcadores genéticos, sendo amplamente utilizados em análises de parentesco, construção de mapas genéticos de alta densidade e estudos filogenéticos e populacionais (GOLDSTEIN & POLLOCK, 1997; KNAPICK et al., 1998; OLIVEIRA et al., 1998).
Os microssatélites são classificados quanto ao tamanho da sua repetição, sendo denominados mononucleotídeos, di, tri, tetra, penta e hexa, para repetições de um, dois, três, quatro, cinco ou seis pares de bases, respectivamente. Eles também podem ser classificados quanto à estrutura da repetição, sendo denominados como perfeitos, quando existe um motivo único de repetição, sem interrupções; imperfeitos, quando existem bases diferentes intercalando a repetição; e compostos quando mais de duas repetições perfeitas ou imperfeitas estão separadas por no máximo 3pb (WEBER, 1990).
O alto grau de polimorfismo encontrado nos microssatélites é resultante da variação no número de repetições de um alelo para outro (LITT & LUTY, 1989; TAUTZ, 1989; WEBER & MAY, 1989). As taxas de mutação para a maioria dos loci de microssatélites são usualmente de várias ordens de magnitude maiores que as taxas de mutação para outros loci dentro do mesmo genoma, que são na ordem de 10-9 a 10-10 ; in vivo tem sido calculada em 10-2 por locus por replicação em Escherichia coli (LEVINSON & GUTMAN, 1987a) e cerca de 10-4 a 10-5 em leveduras (HENDERSON & PETES, 1992). Enquanto a evolução do DNA de cópia única é devida, principalmente, ao acúmulo de substituições de bases, o mecanismo predominante de mutação de microssatélites é a derrapagem da DNA polimerase (SCHLÖTTERER, 2000). Durante o processo de replicação do DNA, as duas fitas podem deslizar (slippage) uma sobre a outra, formando bolhas de DNA não-pareado. Muitas dessas bolhas são corrigidas pelo sistema de reparo de erros, mas uma pequena proporção de bolhas não reparadas resulta no ganho ou na perda de uma unidade repetitiva (ELLEGREN, 2004; LEVINSON & GUTMAN, 1987b).
Os primeiros microssatélites do T. cruzi foram descritos por Oliveira et al. (1998). Esses autores, analisaram o grau de polimorfismo de oito loci de microssatélites em diferentes amostras do T. cruzi e demonstraram que são marcadores com um elevado poder de resolução, uma vez que não foi observada a repetição de um único genótipo multilocal com a análise dessas repetições em um total de 26 amostras (OLIVEIRA et al., 1998) e de 131 amostras do T. cruzi (PIMENTA et al., 2002). Dentre as amostras analisadas, a maior parte apresentou um único pico (homozigose) ou dois picos de tamanhos diferentes (heterozigose) para todos os loci de microssatélites, o que enfatiza, mais uma vez, a estrutura diplóide do genoma do T. cruzi (OLIVEIRA et al., 1998). Entretanto, algumas amostras apresentaram
mais de dois alelos para um determinado locus de microssatélites, sugerindo que estas seriam aneuplóides ou então que elas seriam constituídas de mais de uma subpopulação do parasito, apresentando alelos diferentes para esse locus, ou seja, seriam multiclonais. As amostras que apresentaram mais de dois alelos foram, na sua grande maioria, aquelas isoladas de reservatórios e vetores silvestres, ou de pacientes chagásicos na fase aguda da doença. Essas amostras correspondem, justamente, àquelas que apresentaram alto grau de variabilidade genética identificada pelas técnicas de RAPD e SSR-PCR (OLIVEIRA et al., 1997), indicando que o grau de variabilidade genética observada nessas amostras pode estar intimamente relacionado com uma possível constituição multiclonal de algumas populações do T. cruzi.
Os microssatélites também foram utilizados para averiguar as relações filogenéticas entre isolados do T. cruzi. Primeiramente, 54 amostras do parasito foram analisadas pela abordagem de parcimônia, de acordo com modelo de mutação passo a passo. Utilizando uma distância genética baseada no número de mutações necessárias para uma cepa se transformar em outra, foi construída uma rede de Wagner que permitiu a separação das cepas do grupo 2 para o gene rRNA 24Sα das cepas do grupo 1 e 1/2 (OLIVEIRA et al., 1998). Mais recentemente, Freitas et al. (2006) analisaram 75 amostras do T. cruzi e construíram um gráfico de escala multidimensional, mostrando claramente o agrupamento das cepas do T. cruzi em quatro grupos bem definidos: MDS A (correspondente à linhagem T. cruzi I), MDS C (linhagem T. cruzi II), MDS B (linhagem T. cruzi III) e MDS BH (cepas híbridas).
As amostras do T. cruzi são usualmente obtidas pela cultura de parasitos isolados de triatomíneos ou hospedeiros mamíferos. Os indivíduos que vivem em áreas endêmicas podem ser infectados por vários contatos com diferentes triatomíneos e estes, por sua vez, podem se alimentar de vários indivíduos infectados. Esta característica propicia a formação de populações multiclonais em hospedeiros e vetores, favorecendo o isolamento dessas populações quando cultivadas (MACEDO & PENA, 1998). Sendo assim, a tipagem genética por microssatélites em conseqüência de seu elevado polimorfismo representa uma técnica rápida, reprodutiva e sensível, adequada ao estudo da dinâmica da estrutura populacional do T. cruzi e, ainda, pode indicar se uma cepa é formada por uma população mono ou multiclonal (MACEDO et al., 2001; OLIVEIRA et al., 1997, 1998; VALADARES et al., 2008). Além disso, os microssatélites são marcadores unilocais, o que nos permite determinar exatamente os alelos presentes em uma cepa e fazer inferências populacionais muito mais precisas do que outros marcadores aleatórios, tais como RAPD e SSR-PCR (OLIVEIRA et al., 1997).
De acordo com o exposto acima, a amplificação de microssatélites é uma excelente ferramenta para estudos moleculares do T. cruzi, uma vez que é capaz de caracterizar as diferentes subpopulações desse parasito que formam as cepas naturalmente policlonais e responsáveis pela doença de Chagas. Em nosso trabalho, analisamos o polimorfismo de nove loci de microssatélites, constituídos por repetições de dinucleotídeos SCLE10, SCLE11, MCLF10, MCLG10, MCLE01 (OLIVEIRA et al., 1998); trinucleotídeos e tetranucleotídeos TcATT14, TcAAT8, TcTAT20, TcAAAT6 (VALADARES et al., 2008) para a análise da estrutura populacional do T. cruzi, e ainda uma comparação entre as populações isoladas de um mesmo paciente em diferentes períodos de tempo. Essa metodologia abre nova perspectiva para a compreessão da dinâmica populacional do T. cruzi durante a fase crônica da doença de Chagas, além de estudos populacionais oque nos permitirá entender, cada vez melhor, o papel que diferentes amostras do parasito desempenham na patogênese da doença, distribuição geográfica e nos diferentes índices de cura após a terapêutica específica.
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3. OBJETIVOS