Future perspectives and further work

O transcriptoma compreende um conjunto de transcritos de uma determinada célula, ou uma população celular, que inclui mRNAs codificantes de proteínas e pequenos RNAs não-codificantes (por exemplo ribossomais, tRNAs, miRNAs) (DARDEN et al., 1993). Essas redes de caracteres transcriptômicos constituem uma importante parcela de informação para os organismos eucarióticos (WANG et al., 2010). Na falta de um genoma de referência, a

utilização das análises transcriptômicas de novo surge como uma atraente alternativa, uma vez que oferecem uma abordagem efetiva na descoberta e identificação de transcritos envolvidos em diversos processos biológicos (MUNOZ-MERIDA et al., 2013).

Tradicionalmente, o perfil transcriptômico ou transcriptômica têm se focado na quantificação da expressão gênica, contudo, com o advento das tecnologias de sequenciamento de alto rendimento é possível obter informações estruturais altamente resolvidas de populações de RNA em plataformas de alto rendimento (DARDEN et al., 1993). Entre 1990 e 2000, foram desenvolvidas tecnologias analíticas de sequenciamento de alto rendimento como microarranjos, análise seriada da expressão gênica (serial analysis of gene expression, SAGE), cDNA (amplified fragment length polymorfism, AFLP) entre outras tecnologias (DARDEN et al, 1993). Dentre essas, as análises baseadas em microarranjos foram as mais utilizadas para os estudos de transcriptoma de tecidos vegetais como arroz (HAZEN et al., 2005; KIM et al, 2009), milho (BERENDSEN et al., 1981; MIAMOTO e KOLLMAN, 1992), cevada (DELP et al., 2009; HANSEN et al., 2009), soja (HESS et al., 1997; O’ROURKE et al., β009) e tomate (SOLANO et al., 1998).

A partir de 2005 começaram a ser utilizadas as tecnologias do sequenciamento de nova geração (também chamadas de RNA-Seq), baseadas em plataformas de sequenciamento capazes de gerar informação sobre milhões de pares de bases em uma única corrida (ZHANG et al., 2012).

Em um experimento típico de RNA-Seq, o mRNA pode ser isolado do RNA total e transcrito reversamente dentro de bibliotecas de cDNA com tamanhos homogêneos, o que pode ser realizado tanto com fragmentos de RNA como de cDNA. Adaptadores são adicionados a uma ou a ambas extremidades do RNA, anteriormente à amplificação do cDNA e construção da biblioteca. Para as plataformas Illumina aproximadamente 120 milhões de sequências single-ends ou paired-ends, variando de 75 – 150 pares de bases em seu comprimento podem ser geradas a cada experimento em uma única célula de trabalho (8 lanes/flow cel), que é então processada para seu fim biológico (Figura 3) (DARDEN et al., 1993; ZHANG et al., 2012).

Para processar, interpretar e visualizar os grandes volumes de dados gerados através das tecnologias de RNA-Seq são necessários o desenvolvimento de algoritmos e pipeplines eficientes e sofisticados (DARDEN et al., 1993). Levando em consideração o baixo custo e a alta quantidade de informação gerada, as tecnologias de RNA-Seq são amplamente aplicáveis para a análise genômicas em organismos e sistemas não-modelo. A montagem de um transcriptoma pode ser considerada finalizada quando todos os genes são representados, onde

cada transcrito foi inteiramente coberto por um único contig, o qual pode ser descrito como um conjunto de segmentos de DNA que, juntos representam uma região consenso (GREGORY, 2005; MEYER et al., 2012).

A tecnologia de RNA-Seq pode evidenciar o conjunto de sequências em um tecido específico em um ponto específico de tempo, mesmo tratando-se de transcritos raros. Desta forma, pode-se organizar um quadro quase completo dos eventos transcriptômicos de uma amostra biológica. Os dados gerados são bastante versáteis e podem ser utilizados na caracterização de genes, de variações estruturais, na localização de regiões de splicing alternativo, polimorfismos simples e a localização precisa dos limites de transcrição (ZHONG et al., 2012). Tendo em vista o estudo de organismos não-modelo, essas características são de grande relevância devido à ausência de informação genômica (JIAO et al., 2007; ZENG et al., 2013). Para espécies que permanecem desprovidas de um genoma de referência, o nível de fragmentação e quão incompleta está a montagem do transcriptoma só pode ser estimada através da comparação com genes complementares de espécies relacionadas (MEYER et al., 2012).

Figura 3: Esquema ilustrando os procedimentos experimentais do sequenciamento de nova geração (RNA-Seq).

A orquídea mariposa (Phalaenopsis aphrodite) teve seu transcriptoma analisado através de RNA-Seq, e devido à quantidade de informações genômicas limitadas, a montagem do transcriptoma foi realizada a partir da abordagem de novo. Foi possível categorizar e construir o perfil funcional desta planta não-modelo utilizando-se as plataformas de RNA-Seq com eficácia, gerando informações valiosas para o estudo molecular das orquidáceas (ANNADURAI et al., 2012). Similarmente, os tecidos do aparelho floral das espécies de aguapé Eicchornia paniculata e Eicchornia paradoxa foram eficientemente analisados por RNA-Seq em vários estágios do desenvolvimento floral, demonstrando que esta tecnologia é aplicável à caracterização e comparação de tecidos florais (ROENNEBERG e MERROW, 1999).

Logacheva e colaboradores (2011) demonstraram a utilização da tecnologia de RNA- Seq pela primeira vez em um estudo de análise das respostas transcricionais no desenvolvimento da baga de uva (Vitis vinifera). Os autores identificaram os diferentes níveis de expressão gênica em cada estágio de desenvolvimento, e ainda apresentaram a classificação dos genes em categorias funcionais, demonstrando uma complexidade transcricional significativa para esse organismo. Da mesma forma, a análise transcriptômica realizada em folhas de pêssego (Prunus persica L.) infectadas com a bactéria Xanthomonas arboricola pv. pruni demonstraram uma grande quantidade de genes diferencialmente expressos de receptores de PAMPs e genes de resistência. Foram observados ainda a expressão diferencial de genes relacionados ao controle de fotossíntese, reorganização da parede celular, assim como vias de sinalização hormonal e codificação do citocromo. Os autores verificaram ainda novos transcritos que podem estar relacionados com a interação patógeno-hospedeiro, permitindo dessa forma, a inferência acerca dos possíveis mecanismos de defesa desencadeados pela planta em casos de interação compatível com o patógeno (STRICKLER et al., 2012).

3 MATERIAL E MÉTODOS