A freqüência alélica e genotípica encontrada na população brasileira normal foi semelhante a vários estudos feitos com populações européias (CARRASCOSA et al., 2008; PANTEL et al., 2000)
A frequência genotípica na BRA foi de fl/fl 54,3%, fl/d3 36,2% e d3/d3 9,5%, enquanto a frequência genotípica do grupo de pacientes com BEI foi de fl/fl 78,1%, fl/d3 15,6% e d3/d3 6,3%. As frequências dos polimorfismos em BRA foi de f(GHRfl) 0,724 e f(GHRd3) 0,276, e em BEI foi de f(GHRfl) 0,859 e f(GHRd3) 0,141 (Tabela 9).
Tabela 9: Frequencia dos polimorfismos e genótipos do GHR em BRA e BEI.
População f(GHRfl) f(GHRd3) fl/fl fl/d3 d3/d3
BRA 0,724 0,276 54,3% 36,2% 9,5%
BEI 0,859 0,141 78,1% 15,6% 6,3%
BRA: População brasileira (n=105); BEI: Grupo de pacientes com baixa estatura idiopática (n=28)
O teste (t) de Student mostrou que há diferenças estatísticas significativas entre as frequências dos polimorfismos e do genótipo entre as duas populações (frequência do polimorfismo p-valor 0,001; frequência genotípica p-valor 0,003). Além disso, o teste do Qui-quadrado (X2) mostrou que o grupo com BEI não está em EHW (X2= 3,9995).
Estas duas estatísticas corroboram com as expectativas desta pesquisa, uma vez que o polimorfismo pode influenciar a resposta ao GH, portanto, a estatura do indivíduo. O genótipo fl/fl é bem mais presente neste grupo, sendo este também o genótipo de menor resposta ao GH (DOS SANTOS et al., 2004; JORGE et al., 2006; TOYOSHIMA et al., 2007; WASSENAAR et al., 2009).
A altura é um caso clássico de polimeria, ou seja, é um fenótipo determinado por vários genes. Neste contexto, o polimorfismo do GHR pode desempenhar um efeito aditivo a esta característica, pois o fato do grupo de pacientes com BEI não estarem em EHW e possuir diferenças entre a BRA, significa que esta amostra está ‘viciada’, ou seja, que o critério de seleção (altura) está relacionado ao genótipo do GHR.
Ao se comparar as frequências genotípicas encontradas com outros grupos de BEI publicados (Tabela 10), percebeu-se uma discrepância entre os resultados desta pesquisa com os publicados, porém, quando se comparou apenas os publicados entre si, esta diferença ficou menor. Talvez isto seja fruto da própria origem do estudo, pois se trata de estudos em populações européias (francesa e espanhola) e uma brasileira (esta pesquisa).
Tabela 10: Comparação da frequência genotípica entre diferentes populações com BEI
Estudo N fl/fl fl/d3 d3/d3
(DOS SANTOS et al., 2004) 96 50 (52%) 38 (40%) 8 (8%) (CARRASCOSA et al., 2008) 106 46 (43%) 42 (40%) 18 (17%)
Presente estudo 28 22 (82,1%) 4 (14,3%) 1 (3,6%)
Fonte: (CARRASCOSA et al., 2008; DOS SANTOS et al., 2004)
A tabela compara três populações distintas, sendo uma francesa, uma espanhol e uma brasileira (presente estudo). A frequência de fl/fl é semelhante entre as populações européias, porém discrepantes em relação à população brasileira.
Somado a isso, comparou-se a frequência genotípica da população BRA com uma população normal de coreanos (Tabela 11). Percebeu-se uma grande diferença entre os genótipos, em que o d3 (alelo com maior resposta ao GH) encontra-se diminuído nesta população, que por sua vez, possui uma média de altura menor que a do brasileiro de acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS).
Tabela 11: Comparação da frequência genotípica entre diferentes populações normais.
Estudo N fl/fl fl/d3 d3/d3
(KO et al., 2010) 100 81 (81%) 18 (18%) 1 (1%)
Presente estudo 28 57 (54,3%) 38 (36,2%) 10 (9,5%) Fonte: (KO et al., 2010).
Apesar de a altura ser um caso clássico de fenótipo multifatorial, ainda não se conhece os seus mecanismos de herdabilidade. No entanto, é possível que o GHR possa desempenhar um efeito aditivo a esta característica, mas para se tirar tais conclusões seriam necessários estudos mais aprofundados nos pacientes que não possuem nenhuma mutação em SHOX ou GHR por outras técnicas, como Compartive Genomic Hybridization (CGH) para se buscar novos CNVs pelo genoma.
5.3 ANÁLISE SHOX 5.3.1 MLPA – SHOX
A técnica se mostrou satisfatória, em que o padrão dos picos produzidos pela fluorescência durante a eletroforese no ABI 3130 de cada fragmento foi compatível com o descrito pelo kit (Figura 14). Mas, apesar de aceitável, esta técnica não é tão robusta, pois para o seu perfeito funcionamento é extremamente necessário que as amostras de DNA fossem de boa qualidade. Portanto, havia mais preocupação e
trabalho no preparo das amostras (quantificação, purificação, diluição etc) que na execução da técnica.
Figura 14: Padrão e intensidade dos picos produzidos pelo MLPA no ABI 3130.
Comparação entre o padrão dos picos obtidos pela técnica do MLPA (acima) e o padrão esperado (abaixo), de acordo com o kit.
A posição do SHOX nos cromossomos sexuais, aliada ao fato de estar no PAR1 (RAO et al., 1997) traz consigo particularidades que poderiam gerar diagnósticos falsos positivos ou falsos negativos, e por se localizar em PAR1, ele possui uma cópia em cada cromossomo sexual (X e Y) (BALLABIO et al., 1989; SCHAEFER et al., 1993).
No entanto, existem sondas que identificam genes adjacentes ao SHOX que se encontram fora de PAR1 (ausentes no cromossomo Y). Assim, é esperado metade do sinal para estas sondas em homens (0,5) e o sinal normal em mulheres (1,0) (Figura 15). Para se chegar a estes resultados as amostras controles devem ser rigorosamente do sexo feminino. Caso se usasse controle de ambos os sexos, provavelmente o programa do Coffalyser não seria capaz de realizar as devidas normalizações. Se fossem usadas amostras controles do sexo masculino, uma análise descuidada poderia interpretar os resultados de pacientes mulheres com duplicação.
Figura 15: Resultados normais para MLPA.
Gráfico gerado pelo Coffalyser. Em azul: resultado normal para MLPA de um indivíduo do sexo masculino. Em vermelho: resultado normal para MLPA de um indivíduo do sexo feminino. As sondas destacadas pelo retângulo preto têm seu sinal reduzido em 50% nos homens, pois não estão presentes no cromossomo Y. Obs: amostras de mulheres normais foram usadas como referência.
Foram encontrados alterações de CNV em um total de oito pacientes. No entanto, apenas um deles apresentou deleções relativas ao SHOX (3,6%). As demais deleções foram em genes flanqueiam o SHOX, porém, sem qualquer relevância à BEI (as alterações encontradas pelo MLPA de todos os pacientes encontra-se no Apêndice C). Apesar de esta frequência estar pouco relatada no Brasil, um outro estudo encontrou 5% de deleções no SHOX por MLPA (FUNARI et al., 2008), o que corrobora com resultados encontrados nesta pesquisa.
A paciente 39 apresentou uma grande deleção envolvendo não só o SHOX, como toda a área do SHOX e genes adjacentes (Figura 16) de pelo menos 14,7 Mb. Portanto, a baixa estatura desta paciente é explicada pela hemizigose do SHOX (haploinsuficiência do SHOX) (BINDER et al., 2004). Para corroborar com este resultado, o geneSHOX deste paciente foi sequenciado com o intuito de verificar se havia nenhum tipo de heterozigose (SNP). Além disso, é importante ressaltar que o sequenciamento não detectou nenhuma mutação de ponto neste indivíduo. Isto já era esperado, caso contrário o paciente teria outro fenótipo: displasia mesomélica de Langer (BELIN et al., 1998).
Figura 16: Resultado alterado para o MLPA.
Gráfico gerado pelo Coffalyser mostra uma intensidade de todas as sondas analisadas pelo MLPA no SHOX. C: sondas controle (10 ao total). A altura das barras reduzidas a metade mostra uma deleção de no mínimo 14,7 Mb referente ao SHOX, SHOX área e genes adjacentes.
Os altos picos das sondas AIFM1 e VAMP7 indicam uma duplicação do braço longo do cromossomo X. Portanto, este diagnóstico sugeriu uma grande deleção do braço curto do cromossomo X, com duplicação do braço longo (46, Xp-). Posteriormente esta previsão foi confirmada pela citogenética feita no NuGen.
5.3.2 Sequenciamento – SHOX
Os pacientes em que não foram encontradas deleções no SHOX por MLPA foram investigados por sequenciamento através do método de Sanger (SANGER; NICKLEN; COULSON, 1977) para averiguar possíveis mutações de ponto. Foi encontrada uma variante alélica em um total de 28 pacientes (3,6%).
O paciente 9 apresentou uma substituição de adenina por citosina na posição 86 da sequência codificante (c.A86C; Figura 15), o que corresponde no terceiro nucleotídeo do códon 29, pertencente ao éxon 2, resultando em uma substituição de lisina por uma treonina (p.Lys29Thr) na proteína. Esta mutação já está relatada e associada ao fenótipo de BEI, de acordo com o banco de mutações LOVD (FOKKEMA; DEN DUNNEN; TASCHNER, 2005).
Figura 17: Mutação de ponto em heterozigose em SHOX .
Em preto a sequência depositada no NCBI (Éxon 2 ref; Referência: NG_009385.1). O eletroferograma superior mostra substituição de adenina por citosina na posição 86 da sequência codificante em heterozigose, o que corresponde ao terceiro
nucleotídeo do códon 29 do éxon 2 (p.Lys29Thr). O eletroferograma inferior indica o sequenciamento de um controle normal.
Obs: Embora exista um pico em heterozigose, o software indica apenas uma base a cada posição.
Apesar de a treonina ser um aminoácido com uma hidroxila alifática, o que lhe confere propriedades hidrofílicas (e polares), este é bem diferente da lisina, que por sua vez, possui uma cadeia lateral muito polar, relativamente longa e um grupamento de carga positiva em pH neutro (amina primária) (STRYER; TYMOCZKO; JEREMY, 2004) (Figura 18). Além disso, outras diferenças elementares, como o tamanho dos aminoácidos e mudança no posicionamento da formação das pontes de hidrogênio podem explicar o porquê da inativação do SHOX
A alteração da posição das pontes de hidrogênio relativas ao carbono alfa (Cα) muda de 4 átomos de carbono para 1 átomo de carbono. Esta diferença do posicionamento da ponte de hidrogênio modifica a interação com aminoácidos vicinais, sacrificando a estrutura secundária da proteína (formação de alfa-hélice ou folhas-beta). Além disso, treonina não possui carga positiva como a lisina, por sua vez, pode impedir a formação da estruturas terciária, ou de pelo menos parte da dela (STRYER; TYMOCZKO; JEREMY, 2004).
Figura 18: Lisina e Treonina.
Fonte: (STRYER; TYMOCZKO; JEREMY, 2004)
Esquema representativo da mudança dos aminoácidos da mutação no SHOX. Lisina à esquerda e treonina à direita.
As mutações no SHOX em pacientes com BEI podem variar de 2 a 15%, de acordo com a literatura (BINDER; RANKE; MARTIN, 2003; HUBER et al., 2006; JORGE et al., 2007; MORIZIO et al., 2003; RAPPOLD, G. et al., 2007; RAPPOLD, G. A. et al., 2002). Esta diferença pode ser explicada pela técnica utilizada no diagnóstico, os critérios de seleção, e tamanho e origem da população estudada (FUNARI, 2009).
A comparação de trabalhos que utilizaram sequenciamento em população brasileira pode minimizar estas diferenças. Jorge e cols. sequenciaram um grupo de 63 pacientes com BEI na população brasileira e encontraram uma frequência de mutação neste gene de 3,2% (JORGE et al., 2007), ou seja, semelhante a frequência encontrada nesta pesquisa (3,6%). Portanto, analisando sob esta óptica, a frequência encontrada está de acordo com a literatura.
Por outro lado, a diferença de frequência de mutações de ponto no SHOX em outros trabalhos pode ser explicada pela origem da população. Stuppia e cols. encontraram uma frequência de mutações no SHOX de 12,5% em uma população italiana (STUPPIA et al., 2003). De forma semelhante, Huber e cols. encontraram 14% de mutações no SHOX em população de pacientes com BEI franceses (HUBER et al., 2006). Ou seja, valores bem superiores aos encontrados neste trabalho.
Considerar as frequências de mutações de ponto no SHOX de 3,6% implica inferir que elas tenham a prevalência de 1 a cada 1.333 nascimentos (considerando que 2,08% da população sofre com baixa estatura) (RAPPOLD, G. A. et al., 2002). Em contrapartida, GHD afeta 1 a cada 3.500 crianças e a Síndrome de Turner 1 a cada 2.000 meninas (ou 4.000 crianças) (SAENGER et al., 2001). Assim, a frequência de mutações no SHOX parece similar à GHD e Síndrome de Turner
(RAPPOLD, G. A. et al., 2002), sendo um importante indicativo para se adotar o uso de rhGH nestes pacientes.
5.4 ANÁLISE –GHR
5.4.1 Sequenciamento – GHR
O sequenciamento do GHR foi realizado em todos os pacientes em que não foram encontradas mutações de ponto ou alterações de CNV no SHOX.
Foi encontrada uma única variação alélica em um total de 28 pacientes (frequência de 3,6%) no GHR. O paciente 4 apresentou uma substituição de timina por citosina na posição 559 da sequência codificante do mRNA (Figura 19), o que corresponde ao primeiro nucleotídeo do códon 187, pertencente ao éxon 6, resultando em uma substituição de triptofano por uma arginina (p. Trp187Arg).
Figura 19: Mutação de ponto em heterozigose em GHR.
Em preto a sequência (Exon 6 ref) depositada no NCBI (Referência: NG_011688.1). O eletroferograma superior mostra duas substituições em heterozigose: SNP 6179 (descrito no dbSNP); e mutação na posição 559 da seqüência condificante do mRNA de uma timina por citosina, o que corresponde ao primeiro nucleotídeo do códon 187, pertencente ao éxon 6, resultando em uma substituição de triptofano por uma arginina (p.Trp187Arg). O eletroferograma inferior indica o sequenciamento de um controle normal.
Esta variação foi primeiramente investigada nos bancos de dados do dbSNP OMIM e LOVD, no entanto, ela não foi encontrada em nenhum deles. Para avaliar qual o impacto esta mutação poderia trazer ao fenótipo da baixa estatura, foram
feitas, inicialmente, uma análise teórica da bioquímica dos diferentes aminoácidos e, posteriormente, uma modelagem in silico para avaliar o seu contexto dentro da proteína e na interação GH-GHR.
O triptofano é um dos maiores aminoácidos existentes na natureza. Ele possui um anel indólico (dois anéis aromáticos fundidos e um grupamento NH) (STRYER; TYMOCZKO; JEREMY, 2004), conferindo-lhe um caráter predominantemente apolar. Em contrapartida, a arginina é um aminoácido bem menor, de cadeia longa, extremamente polar, alifática (não aromática) e cadeia normal (não ramificada) (STRYER; TYMOCZKO; JEREMY, 2004). Ou seja, aminoácidos de cadeia e comportamento totalmente antagônicos (Figura 20).
Figura 20: Triptofano e Arginina.
Fonte: (STRYER; TYMOCZKO; JEREMY, 2004)
Esquema representativo da mudança dos aminoácidos da mutação do GHR. Triptofano à esquerda e arginina à direita.
Apesar das várias diferenças entre os aminoácidos, a avaliação destes deve ser feita dentro do contexto da estrutura terciária de sua proteína, para considerar o impacto desta mudança. Orignalmente, o triptofano é flanqueado por outras argininas, que através de suas cargas positivas, repulsam o aminoácido, promovendo sua sustentação e o correto arranjo no espaço (CLACKSON et al., 1998). Portanto, se há a sua substituição por um aminoácido de mesma carga, a tendência é que sejam repelidos ainda mais, modificando assim, os seus ângulos e sua estrutura terciária.
Mais importante que isto é atentar para a mudança das interações entre o GH e o GHR. Para o GH estabelecer uma ligação estável ao seu receptor, ele interage
com GHR através das cadeias GHR), formando ‘sanduíche
A interação superior é molécula do dímero de GHR houve a troca de posição investigação mais detalhada, combinada ao GH (Figura 21
Figura 21: Local de interação do Triptofano 187 com
Fonte: Adpatado de PDB, 2012. À esquerda a figura mostra a int do triptofano (indicado pela seta ve
direita uma maior riqueza de detalhes, indicando a im para a interação entre estas duas pr
Corroborando com a demonstrou que o local de hidrofóbico central determinado periferia hidrofílica (formada orientação dos resíduos de tri triptofano contribuem com cerca seu anel indólico (entidade múltiplas interações de Van
Trp187 é previsto a fazer interação Assim, a substituição de Trp
das cadeias laterais de isoleucinas (do GH) com triptofanos sanduíches’ (CLACKSON et al., 1998).
superior é feita pelos Trp122e a inferior é feita pelo de GHR (CLACKSON et al., 1998). Exatamente no posição dos aminoácidos do paciente em questão detalhada, foi feito uma modelagem in silico da proteína
21).
: Local de interação do Triptofano 187 com GH.
Fonte: Adpatado de PDB, 2012.
À esquerda a figura mostra a interação do GH (em azul) com o GHR (verde) através do triptofano (indicado pela seta vermelha) na posição 187 com isoleucina
direita uma maior riqueza de detalhes, indicando a importância deste aminoácido para a interação entre estas duas proteínas.
com a análise in silico, um estudo feito por Clackson local de ligação do hormônio ao receptor compreende
determinado por Trp122 e Trp187 do GHR, rodeado (formada por argininas) que serve de arcabouço esíduos de triptofanos chaves (Figura 22). Juntos, estes r
com cerca de 20% da área total da superfície de (entidade química ausente na arginina) é capaz
an der Walls (CLACKSON et al., 1998). Especificamente, fazer interação com Ile179 do GH, que é outro aminoácido
de Trp por Arg implica num efeito contrário, uma
com triptofanos (do
pelo Trp187de cada Exatamente no sítio em que questão. Para uma roteína mutada,
o GHR (verde) através isoleucina do GH. À portância deste aminoácido
Clackson e cols. compreende um sítio
rodeado por uma arcabouço para a Juntos, estes resíduos de de contato, pois capaz de realizar Especificamente, o outro aminoácido polar. contrário, uma vez que a Ile
do GH e a Arg mutada do GHR são incompatíveis com interação (ambas são carregadas positivamente), tendendo a um afastamento entre as moléculas.
Figura 22: Sítio de ligação do Trp187.
Fonte: (CLACKSON et al., 1998)
Sítio de interação do Trp169 (W169) do GHR (em verde) com resíduos de isoleucina da hélice 4 de GH.
Obs: A diferença de numeração de 187 ou 169 ocorre porque o autor não considerou a seqüência sinal de 18 aminoácidos do GHR.
Portanto, a substituição deste aminoácido poderia causar um colapso na interação entre as duas moléculas. Para comprovar isso, o mesmo grupo fez um estudo in silico simulando a substituição de diversos aminoácidos (do GH) eleitos (através de bioinformática) como importantes para a interação GH-GHR por alanina. E, diferentemente da alanina que é um aminoácido pequeno e inócuo, a alteração da arginina (carregado positivamente), causaria um impacto maior nesta simulação (mensurado pelo aumento de ΔΔG; Figura 23).
Figura 23: Afinidade de ligação entre GHR e GHs mutantes.
Fonte: (CLACKSON et al., 1998)
O maior valor de ΔΔG (>4,5) foi exatamente nos dois triptofanos descritos. Isto significa uma incompatibilidade de interação entre os aminoácidos do sítio de acoplamento do GH-GHR, ou seja, implica na perda de afinidade entre as duas proteínas.
Obs: A diferença de numeração de 187 ou 169 ocorre porque o autor não considerou a seqüência sinal de 18 aminoácidos.
Desta forma, a substituição p.Trp187Arg encontrada no paciente 4 explica a sua baixa estatura, já que esta mutação implica na diminuição drástica de afinidade do GH pelo GHR.
6 CONCLUSÃO
Todas as técnicas foram testadas e padronizadas, estando, portanto, prontas para o uso rotineiro dentro de um laboratório de serviço diagnóstico.
A validação da genotipagem dos polimorfismos GHRd3 e GHRfl usando o SNP rs6873545 por qPCR se mostrou 100% confiável, quando comparada à genotipagem por PCR. Além disso, provou ter inúmeras vantagens sobre esta, o que a torna a mais indicada para o uso de grandes rotinas laboratoriais.
A frequência alélica e genotípica deste polimorfismo se mostrou significativamente diferente nas duas populações investigadas: BEI (n=28) e BRA (n=105). Somado a isso, a população de BEI não estava em EWH, o que sugere que estes alelos podem ter uma parcela de contribuição na herdabilidade da altura (fenótipo de expressão multifatorial) e que a genotipagem na população brasileira parece ser mais informativa que em outras populações, uma vez que a frequência de fl/fl foi 23,8% maior em BEI. Porém, ainda são necessários mais estudos dentro do genoma humano (como, por exemplo, com CGH) para se compreender melhor este fenótipo.
As três técnicas de diagnósticos, propostas para esta pesquisa, mostraram-se eficientes, uma vez que funcionaram dentro do esperado e, além disso, em todas elas, foram diagnosticadas mutações: MLPA do SHOX (3,6% de mutação); sequenciamento do SHOX (3,6% de mutação); e sequenciamento do GHR (3,6% de mutação), sendo que a mutação no GHR ainda não havia sido relatada na literatura. Deste modo, foram feitas apenas projeções hipotéticas sobre seu impacto na interação GH-GHR. Assim, para sua confirmação ainda são necessários mais testes de modelagem in silico e experimentos laboratoriais.
A padronização dos protocolos diagnóstico-molecular, bem como sua capacidade de diagnosticar mutações (ou não) no DNA, refletem o principal objetivo deste trabalho, que é a implantação de um serviço diagnóstico genético-molecular no Distrito Federal. Assim, para este braço do centro, todos os parâmetros para sequenciamento de SHOX e GHR, MLPA do SHOX e genotipagem do GHR foram estabelecidos.
Em relação aos princípios farmacogenéticos e de saúde pública, o governo brasileiro ainda não apóia tratamento com GH em pacientes com mutações no SHOX. Futuramente, quando este protocolo for aprovado pelo governo, o trabalho
descrito aqui será mais significante, pois servirá de subsídio para indicar o tratamento apropriado para pacientes com BEI.
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